MICROBIOLOGIA MDICA

Medios de cultivo y pruebas bioqumicas para la identificacin de bacterias

LUIS RAL ROS MADRID
Catedrtico: M.C. Georgina Escudero Hermosillo

Cultivo de microorganismos

Proporcionar a un microorganismo los nutrientes que le aporten energa y elementos qumicos para la sntesis de sus constituyentes celulares, para su cultivo o crecimiento en un medio controlado.

Medios de cultivo no selectivos enriquecidos

Tipos de medios de cultivo

Medios de cultivo selectivos y diferenciales

Medios especializados

Medios de cultivo no selectivos enriquecidos

Estn diseados para permitir el crecimiento de la mayor parte de grmenes que no necesitan condiciones exigentes.

Agar sangre:

Contiene dos compuestos, un medio basal (soja, cerebro-corazn) y sangre de oveja, caballo o conejo.

La presencia de sangre permite la determinacin de la hemlisis, criterio bsico en la orientacin hacia la identificacin bacteriana.

Ejemplo de hemlisis caractersticas:

-Streptococcus pneumoniae: hemlisis, con una coloracin verdosa alrededor de la colonia. -Streptococcus pyogenes: -hemlisis, con una zona transparente alrededor o debajo de la colonia.

Agar chocolate:

Un agar modificado. Agregar sangre o hemoglobina al medio de base calentado, este se vuelve marrn. Permite el crecimiento de mayor parte de las bacterias.

Agar Mueller-Hinton:

Recomendado para estudios convencionales de susceptibilidad bacteriana (sensibilidad a los antimicrobianos). Su composicin incluye extractos de ternera y casena, sales, cationes divalentes y almidn.

Medio de tioglicolato:

Medio de cultivo de enriquecimiento para empleados para recuperar cantidades pequeas de bacterias aerobias y anaerobias, se compone de casena, glucosa, extracto de levadura, cistena y tiogliconato sdico. El suplemento de Hemina vitamina K mejora la recuperacin de las bacterias anaerobias.

Agar de dextrosa de Sabouraud:

Medio enriquecido que contiene casena y tejido animal digeridos suplementados con glucosa, se emplea para aislar hongos y levaduras, utiliza un pH bajo y concentracin baja de glucosa lo que elimina bacterias y as el cocimientos de hongos.

Medios de cultivo selectivos y diferenciales

Se utilizan para recuperar grmenes especficos que pueden estar presentes en una mezcla de otros grmenes. Los medios se enriquecen con inhibidores que suprimen el crecimiento de los grmenes no deseados. Estos medios se hacen diferenciales aadiendo ingredientes especficos que permiten la identificacin del fermen en una mezcla.

Agar MacConkey: Para las bacterias gramnegativas y diferencial para distinguir las bacterias que fermentan la lactosa y las que no. Este medio incluye peptonas digeridas, sales biliares y el violeta cristal inhiben las bacterias grampositivas. Las bacterias que fermentan la lactosa producen cidos, que precipitan las sales biliares y provocan un color rojo del indicador rojo neutro.
Colonias tpicas: Las colonias de los microorganismos fermentadores de lactosa (coliformes) en agar MacConkey son de color rojo ladrillo, eventualmente rodeadas de bilis precipitada.

Agar sal manitol:

Se trata de un medio de cultivo selectivo empleado para aislamiento de estafilococos. El medio incluye extractos de casena y tejidos animales digeridos, extracto de ternera, manitol, sales y rojo fenol. Los estafilococos pueden crecer en presencia de una elevada concentracin de sal y S. aureus puede fermentar manitol, produciendo colonias de color amarillo e este agar.

Agar Xilosa-lisina-desoxicolato (XLD)

Agar selectivo utilizado en la detencin de Salmonella y Shigella en cultivos entricos. Es un extracto de levaduras con xilosa, lisina, lactosa, sacarosa, desoxicolato sdico, tiosulfato sdico, citrato amnico frrico y rojo fenol.

El desoxicolato sdico inhibe el crecimiento de la mayor parte de las bacterias no patgenas. Las bacterias que crecen tpicamente fermentan la lactosa, la sacarosa o la xilosa y dan lugar a colonias amarillas. Shigella no fermenta estos carbohidratos, de forma que sus colonias sern rojas. Salmonella fermenta la xilosa, pero tambin descarboxila la lisina y genera el producto alcalino diamino cadaverina, las colonias sern rojas. La mayor parte de Salmonellas las colonias se vuelven negras lo que permite diferenciar Salmonella de Shigella.

Medio de Lowenstein-Jansen (Lj)

Utilizado para aislar microbacterias, contiene gliseron, harina de patata, sales y huevos coagulados. Se aade verde malaquita para inhibir las bacterias grampositivas.

Agar Middlenrook

Para aislar micobacterias, contiene sales, vitaminas, cido oleico, albmina, catalasa, glicerol, glucosa y verde malaquita par a inhibir grampositivas. Se solidifica con agar.

CHROMagar:
Agar selectivo diferencial para aislar e identificar especies distintas de lavadura Candidia. Contiene cloranfenicol para inhibir las bacterias y una mezcla se sustratos cromognicos especiales. Unos ejemplos son: C. albicans genera colonias verdes, C. tropicalis genera colonias moradas y C. Krusei las genera todas

Pruebas bioqumicas para la identificacin de bacterias

consisten en distintos test qumicos aplicados a medios biolgicos, los cuales, conocida su reaccin, nos permiten identificar distintos microorganismos presentes. Su sistema de funcionamiento generalmente consiste en determinar la actividad de una va metablica a partir de un sustrato que se incorpora en un medio de cultivo y que la bacteria al crecer incorpora o no. Para realizar las pruebas bioqumicas se dispone de mltiples medios, los cuales se deben aplicar de acuerdo a las exigencias del microorganismo en estudio. De la amplia variedad de pruebas bioqumicas, nosotros en laboratorio utilizaremos 10, aplicados a 5 especies de microrganismos. Adems estudiaremos los resultados que estos test arrojan, comparando resultados experimentales entre los distintos grupos de trabajo de nuestro laboratorio.

Prueba de la Oxidasa

El objetivo de la prueba Oxidasa es buscar la presencia de la enzima Citocromo C oxidasa. Se trata de un enzima que oxida el citocromo C de la cadena transportadora de e-. Este se detecta utilizando el tetra para fenilendiamina: el reactivo de oxidasa contiene este compuesto que va a ser oxidado por la citocromo C oxidasa. En estado reducido es incolora, pero cuando se oxida vira a prpura. Procedimiento: Con un pequeo papel de filtro aadimos reactivo de Kovacs, lo impregnamos y a partir del tubo con la bacteria problema tomamos un poco con el asa de platino y ponemos en el papel. Tras unos 30 segundos, observamos si ha ocurrido algn cambio. Las bacterias que dan positivo a esta prueba tienen generalmente un ciclo respiratorio oxidativo. Se considera positiva esta prueba cuando toma un color prpura la muestra. Resultados: (+) Pseudomonas aeruginosa ( - ) Escherichia coli

Prueba de la Catalasa
El Objetivo es buscar la presencia de la enzima catalasa El perxido de hidrgeno se produce al utilizar la bacteria el azcar por va oxidativa. Al ser ste un compuesto muy oxidante las bacterias la eliminan mediante la produccin de la enzima catalasa (H2O2 -> H2O + O2).

Procedimiento: Agregamos aproximadamente 5 ml. de perxido de hidrgeno al 3% a un tubo de ensayo previamente esterilizado a continuacin tomamos una muestra de la cepa del microorganismo a estudiar y la introducimos por el tubo de ensayo, la muestra solamente debe aclararse a la muestra de la solucin liquida de perxido de hidrogeno y debemos observar la reaccin de esta.
La prueba se considera como positiva si observamos burbujas de oxgeno. Resultados: (+) Staphylococcus aureus ( - ) Streptococcus spp.

Prueba de la Coagulasa
La coagulasa es un enzima capaz de desnaturalizar la bibrina del plasma. El objetivo es buscar en factor de aglutinacin de los microorganismos cuando estos se mezclan con el plasma. Esta prueba se utiliza para diferenciar microorganismos del genero Staphylococcus. Procedimiento: Preparamos una mezcla de 0,1 ml. de CCC (caldo cerebro corazn) y 0,3 ml. de plasma de conejo en un tubo de ensayo previamente esterilizado. La muestra ya contiene cepas de St. Aureus. Tapamos el tubo de ensayo con algodn hidrofbico y lo llevamos a bao Mara a 37 C durante una hora, observando la muestra cada 15 minutos. Al completa la hora, sacamos las muestras y observamos sus resultados.

Resultados: Estratificaremos los resultados en 4 distintos niveles: 1: pequeos cogulos no organizados 2: pequeos cogulos organizados 3: gran cogulo organizado 4: todo el contenido aparece coagulado y se mantiene cuando invierte el tubo. Se consideran positivos los niveles 3 y 4. (+) Staphylococcus aureus ( - ) Staphylococcus epidermis

Prueba MIO (Motility-Indole-Ornitine Motilidad-IndolOrnitina) Esta prueba bioqumica permite identificar bacterias de acuerdo a su motilidad a la reaccin de Indol a la descarboxilacin de la ornitina. Procedimiento: Inocular en picada las cepas de microorganimos en el medio de cultivo e incubar por 24 horas a 37 . Reaccin Interpretacin Interpretacin y Resultados: Enturbiamiento del
Agar. Agar transparente desarrollo solo en picada Azul (alcalino)

Hay movilidad No hay movilidad Descarboxila ornitina No descarboxila

Coloracin Amarilla (cido) Rojo (anillos)

Amarillo (anillos)

Indol (+)
Indol ( - )

Prueba TSI (Triple Sugar Iron Triple Azcar Hierro)

El TSI es un medio nutriente y diferencial que permite estudiar la capacidad de produccin de cido y gas a partir de glucosa, sacarosa y lactosa en un nico medio. Tambin permite la identificacin de la produccin de SH2. Esta es una prueba especfica para la identificacin a nivel de gnero en la familia Enterobacteriaceae, con objetivo de diferenciar entre: bacterias fermentadoras de la glucosa bacterias fermentadoras de la lactosa bacterias fermentadoras de sacarosa bacterias aerognicas bacterias productoras de SH2 a partir de sustancias orgnicas que contengan azufre. Prodedimiento: Inocular los tubos de TSI con punta (alambre recto). Para eso introducir la punta hasta 3 a 5 mm. del fondo del tubo. Tras retirar el alambre del fondo, estriar el pico con un movimiento hacia uno y otro lado. Incubar a 35 durante 24 horas. Posteriormente se debe medir el pH de los cultivos. Resultados: Pico alcalino/fondo alcalino : no hay fermentacin de azucares. Caracterstica de bacterias no fermentadoras como Pseudomonas sp. Pico alcalino/fondo cido : Glucosa fermentada, lactosa ni sacarosa fermentadas. Shigella spp. Pico alcalino/fondo negro : Glucosa fermentada, ni lactosa ni sacarosa fermentadas, produccin de cido sulfhdrico. Salmonela spp. Pico cido/fondo cido: Glucosa y lactosa y/o sacarosa fermentadas. Puede producirse SH2 o no. Escherichia coli. A estos resultados se les agrega el resultado de la produccin de gas.

Prueba LIA (Lisien Iron Agar Agar Lisina Hierro)

Esta prueba permite diferenciar los microorganimos que producen descarboxilacin o desaminacin de la lisina. Se pude detectar ademas la produccion de SH2 y es ms sensible que el TSI para la deteccin de SH2. Es muy utilizado par descartar Salmonella de aislamientos primaros. Procedimiento: Inocular en forma de estra las cepas de microorganimos en el medio de cultivo e incubar por 24 horas a 37 . Reaccin Interpretacin Interpretacin y Resultados: Azul (alcalino) Hay movilidad Rojo Engreimiento Ruptura del Agar No hay movilidad Descarboxila ornitina No descarboxila Descarboxilacin de lisina

Fondo Amarillo y Tendido prpura

Pruebas Bioqumicas IMViC:

Son cuatro pruebas bioqumicas. Se emplean fundamentalmente para la identificacin de las Enterobacterias (bacilos Gram negativos, anaerobios facultativos con metabolismo fermentador). Dependiendo de las condiciones, las enterobacterias, pueden realizar un metabolismo aerobio (si disponen de oxgeno), realizar una respiracin anaerobia (si hay nitratos u otro aceptor de electrones) y distintas fermentaciones.

Agar Citrato
La utilizacin de citrato como nica fuente de carbono es una prueba til en la identificacin de enterobacterias. La utilizacin de citrato como nica fuente de carbono se detecta en un medio de cultivo con citrato como nica fuente de carbono mediante el crecimiento y la alcalinizacin del medio. Este aumento de pH se visualiza con el indicador azul de bromotimol que vira al alcalino a pH 7,6.
Procedimiento: Se inocula el agar inclinado en una sola estra en el pico. Utilizar un cultivo de 24 horas en un medio slido y cuidando no arrastrar medio de cultivo, ya que se pueden producir falsos positivos por crecimiento a partir del medio de cultivo del inculo. Incubar a 35C durante 4 das. El ensayo es positivo cuando se observa crecimiento a lo largo de la estra, acompaado o no de un viraje del indicador al azul. Resultados: (+)Klebsiella spp. ( - ) Escherichia Coli

Indol
El indol es uno de los productos de degradacin metablica del aminocido triptofano. Las bacterias que poseen la triptofanasa son capaces de hidrolizar y desaminar el triptofano con produccin de indol, cido pirvico y amonaco. La produccin de indol es una caracterstica importante para la identificacin de muchas especies de microorganismos. La prueba de indol est basada en la formacin de un complejo rojo cuando el indol reacciona con el grupo aldehdo del p-dimetilaminobenzaldehdo. Este es el principio activo de los reactivos de Kovacs y Ehrlich. El medio de cultivo utilizado debe ser rico en triptofano.
Procedimiento: Inocular el caldo triptofano con el organismo en estudio e incubar a 35C durante 18 a 24 horas. Al finalizar este perodo, aadir 5 gotas de reactivo de Kovacs por la pared interior del tubo. El desarrollo de un vivo color rojo fucsia en la interfase del reactivo y el caldo, segundos despus de aadir el reactivo indica la presencia de indol y una prueba positiva. Resultados: (+) Escherichia coli ( - ) Klebsiella pneumoniae

Rojo Metilo
Una de las caractersticas taxonmicas que se utilizan para identificar los diferentes gneros de enterobacterias lo constituyen el tipo y la proporcin de productos de fermentacin que se originan por la fermentacin de la glucosa. Se conocen 2 tipos generales: La fermentacin cido-mixta y la fermentacin del 2,3 butanodiol. En la fermentacin cido mixta se forman fundamentalmente lctico, actico y succnico, adems de etanol, H2 y CO2. En la va del butanodiol se forman cantidades menores de cido (acetato y succinato) y los principales productos son el butanodiol, etanol, H2 y CO2. El rojo de metilo es un indicador de pH con un intervalo entre 6,0 (amarillo) y 4,4 (rojo), que se utiliza para visualizar la produccin de cidos por la va de fermentacin cido mixta. Procedimiento: Inocular el caldo Rojo Metilo con un cultivo puro de no ms de 24 horas del microorganismo en estudio. Incubar a 35C durante 48 horas. Luego de finalizado el tiempo de incubacin agregar unas gotas del reactivo de rojo de metilo. La prueba es positiva si se desarrolla de un color rojo estable. Esto indica que la produccin de cido es suficiente para producir el viraje del indicador y el microorganismo ferment la glucosa por la va de cido mixta. Un color anaranjado, intermedio entre el rojo y el amarillo no es considerado como positivo. Resultados: (+) Escherichia coli ( - ) Enterobacter aerogenes

Vogues Proskauer
En la prueba de Voges-Proskauer se determina la va de fermentacin del butanodiol descripta en la prueba de rojo de metilo. El acetil-metil-carbinol (o acetona) es un producto intermediario en la produccin de butanodiol. En medio alcalino y en presencia de oxgeno la acetona es oxidada a diacetilo. Este se revela en presencia de alfa-naftol dando un color rojo-fucsia. Procedimiento: Inocular el caldo RMVP con un cultivo puro de no ms de 24 horas del microorganismo en estudio. Incubar a 35C durante 24 horas. Luego de finalizado el tiempo de incubacin transferir 1 ml del caldo RM/VP a un tubo limpio y agregar 0,6 ml de alfanaftol al 5% y 0,2 ml de KOH al 40%. Agitar el tubo cuidadosamente para exponer el medio al oxgeno atmosfrico y dejarlo reposar durante 10 a 15 minutos. El desarrollo de un color rojo-fucsia luego de 15 minutos indica la presencia de diacetilo, producto de oxidacin de la acetona y por lo tanto una prueba VP positiva.

Resultados: (+) Enterobacter aerogenes (-)Escherichia coli

Fuentes de consultas:

Microbiologa mdica Murray Microbiologa Brock http://milksci.unizar.es/bioqui mica/temas/azucares/agar.html http://www.unavarra.es/genmic/microgral/Tema%2002.-%20Cultivo%20de%20microorganismos.pdf Microbiologa General Tema 2.- Cultivo de microorganismos. http://www.biomerieux.es/servlet/srt/bio/spain/dynPage?open=SPN_CLN_PRD&doc=SPN_CLN_PRD_G_PRD_CL N_93&pubparams.sform=5&lang=es https://www.google.com.mx/search?q=AGAR+SABOURAUD+DEXTROSA&espv=210&es_sm=122&source=lnms&t bm=isch&sa=X&ei=sOn8UqHxCMmCygHznoDQBg&ved=0CAkQ_AUoAQ&biw=1366&bih=667#facrc=_&imgdii=_ &imgrc=FQ4uU1H4VJM_NM%253A%3B77XyCnZydQYfyM%3Bhttp%253A%252F%252Fupload.wikimedia.org%252F wikipedia%252Fcommons%252F6%252F62%252FSporothrix_schenckii_PHIL_3943_lores.jpg%3Bhttp%253A%252F%25 2Fes.wikipedia.org%252Fwiki%252FAgar_Sabouraud%3B700%3B484 http://www.ucv.ve/fileadmin/user_upload/facultad_farmacia/catedraMicro/macconkey.pdf http://html.rincondelvago.com/pruebas-bioquimicas.html