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TECNICAS PARA EL ESTUDIO DE LINFOCITOS

Rta inmune adaptativa mediada por linfocitos es estudiada mediante:


Aislamiento Separacin poblaciones-subpoblaciones comportamiento

No es posible diferenciar los linfocitos T de los B por microscopa ordinaria, ni en la sangre ni en los rganos linfoides, aunque s se observan algunas diferencias por microscopa electrnica de barrido. No obstante, se disponen de varios mtodos que permiten diferenciar y cuantificar los linfocitos, sus diferentes subpoblaciones e incluso su capacidad de responder a distintos antgenos. Los mtodos para el estudio de los linfocitos, ms utilizados en la actualidad, los podemos agrupar en: .- Determinacin de marcadores y receptores de membrana. .- Determinacin de antgenos de membrana. .- Pruebas funcionales.

TECNICAS PARA EL ESTUDIO DE LINFOCITOS

Aislamiento de linfocitos: Gradiente sobre Ficoll/Hypaque (Boyum 1968) Humanos: Sangre Perifrica Organos M. experimental : bazo, NL, timo

Importante conocer si se requiere esterilidad . Rendimiento: 1-2 x 106cel / ml

TECNICAS PARA EL ESTUDIO DE LINFOCITOS


1.- Marcadores y receptores de membrana. Estos mtodos han sido tradicionalmente utilizados para diferenciar y cuantificar poblaciones de linfocitos B y T. Estos marcadores convencionales, estn basados en las caractersticas especficas de ciertos receptores de membrana, presentes en ambas poblaciones de linfocitos. Los principales marcadores son:
Principales receptores utilizados tradicionalmente para diferenciar los linfocitos T de los B

Linfocitos B:

Inmunoglobulinas de superficie

Linfocitos T:

Rosetas con eritrocitos de carnero

Linfocitos B

Linfocitos T

.- Para los linfocitos B: inmunoglobulinas de superficie que pueden ser detectadas con suero policlonales o Acs. monoclonales marcados con fluorescencia (isotiocianato de fluorescena). En el microscopio de fluorescencia se puede observar que en la membrana aparece una reaccin fluorescente positiva.

.- Para los linfocitos T:


Rosetas con los eritrocitos. Los linfocitos T presentan la caracterstica de formar Rosetas cuando se unen a los eritrocitos de carnero.Actualmente se usan mtodosen los que GRC se tratan con neuroaminidasa o AET( 2-aminoethylisothiouronium bromide) para aumentar la unin de las cel. T. Se pueden cuantificar los linfocitos mediante el marcaje con naranja de acridina y la posterior observacin al microscopio de fluorescencia y luz ordinaria a la vez. Los linfocitos T y B se marcan con la naranja de acridina, presentando los linfocitos T rosetas mientras que los B se marcan con la naranja de acridina pero no forman rosetas. E

E
Rendimiento: > 95% cel. T, < 1% cel. B y ~ 2% monocitos Poblacin no T: < 2% cel. T, 40% cel. B y 60% monocitos

E E

E E E

2.- Antgenos de membrana : Expresin diferencial de marcadores de


superficie y disponibilidad de AcMo con especificidad deseada

Tcnicas:
.- Lisis Ac/Complemento .- Panning .- S. Magntica
.- Anlisis por citometra de flujo. .- Inmunohistoqumica.

Identificacin

Separacin

- positiva

Panning:
- negativa Ag Ag Ag+ Ag Ag Ag Rendimiento: > 90% pureza y viabilidad

Ag -

Ag+

Ag+

Ag+

Wysocki y Sato,1978; Mage y col,1977 Engleman y col,1982; Payne y col, 1981

Placa sensibilizada Ac

Subpoblaciones de linfocitos pueden ser separados fisicamente usando Acs acoplados a perlas magnticas

Ventajas: pureza, reproducibilidad, manejo de cantidades variables de clulas ( 10 6 a 1010 clulas).

Rendimiento: > 98% pureza

Anlisis por citometra de flujo.

El citmetro de flujo es un aparato que permite caracterizar e incluso separar las diferentes poblaciones linfocitarias in vitro mediante el uso de anticuerpos monoclonales marcados con fluorescena, PE,etc; frente a los marcadores de superficie especficos de cada subpoblacin que se desee estudiar.

Las clulas, sobre las que se adicionan los monoclonales (se pueden valorar varios a la vez) frente al marcador objeto de estudio (CD2, CD4, CD8, etc.) pasan a travs de un haz de un lser que detecta su capacidad para dispersar la luz (tamao de las clulas) y la fluorescencia que emiten (tipo de clula). Las mediciones obtenidas se indican en porcentajes de cada poblacin.

Costoso... Exacto, rpido y fcil en manos experimentadas

Citometra de Flujo

Side scatter

G M

L
E Forward scatter (size)

Inmunohistoqumica. Utilizando anticuerpos monoclonales, marcados con fluorescencia o con peroxidasa, frente a los diferentes linfocitos, se puede valorar la situacin de estas clulas en cualquier tejido. Incluso utilizando dos anticuerpos monoclonales, cada uno frente a una poblacin linfocitaria distinta, y cada uno marcado con una enzima diferente (doble marcaje) (peroxidasa fosfatasa alcalina) se pueden estudiar dos poblaciones celulares a la vez en cualquier tejido .

3.- Pruebas funcionales:

Estos mtodos de estudio se basan en valorar la capacidad que tanto los linfocitos T como los B tienen para reconocer a un antgeno determinado. Las tcnicas ms utilizadas son: Estimulacin blstica o Blastognesis La actividad citotxica de los linfocitos T (CD 8+)

La utilizacin de la transformacin linfocitaria, blastognesis o proliferacin es actualmente una de las tcnicas ms precisas y difundidas para el estudio de la capacidad de estimulacin especfica y no especfica de los linfocitos in vitro. Esta tcnica se basa en la capacidad que los linfocitos tienen para responder frente a un antgeno (respuesta especfica) que por vacunacin o por sufrir una infeccin, ha inducido linfocitos memoria.

Los linfocitos al estar de nuevo en contacto con el antgeno inducen una proliferacin, la cual puede ser inducida de forma no especfica gracias a la capacidad de los linfocitos de reaccionar con diferentes tipos de lectinas o mitgenos. Los mitgenos inducen una estimulacin blstica de tipo inespecfico tanto en los linfocitos B como en los T.

TECNICAS: a.- Incorporacin de 3H dentro del ADN de las clulas. b.- FACS contenido de ADN-ARN (proliferacin de clulas individuales) c.- Ensayos colorimtricos: MTT (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)2,5diphenyltetrazolium bromide) y SDS

Funciones efectoras de cel. T . Qu podemos medir ?


Secrecin de citoquinas en Sn de cultivo. Efectos regulatorios sobre cel. B ( por ej. cuantificar niveles de Ig) Actividad citotxica.

La actividad citotxica de los linfocitos T(CD8+)

La actividad citotxica de los linfocitos T (CD 8+) frente a una clula blanco se puede estudiar, midiendo la capacidad de destruccin, que un determinado nmero de linfocitos T tienen para destruir un determinado nmero de clulas blanco, al estar ambas poblaciones en contacto. Hay varios mtodos para poder valorar el porcentaje de lisis o muerte celular que expresan las clulas blanco, aunque el ms utilizado por su precisin, sensibilidad y reproducibilidad, es el de la liberacin de cromo 51 procedente de las clulas blanco.

Este mtodo consiste, brevemente, en lo siguiente: Las clulas blanco (que expresan los antgenos determinados en su membrana) son marcadas con Cromo 51 y puestas en contacto en una proporcin adecuada con las clulas efectoras (linfocitos T). Tras incubar ambas poblaciones celulares conjuntamente por un periodo de incubacin determinado, se centrifugan y seguidamente una parte del sobrenadante resultante es medido mediante un contador de partculas gamma para conocer el porcentaje de cromo 51 liberado al medio. A mayor cantidad de cromo liberado mayor actividad citotxica.

Produccin de citoquinas in vitro: a.- Inmunoensayos. b.- Bioensayos

INMUNOENSAYOS: ELISA

Ventajas: Especificidad, rapidez y facilidad Desventajas: sensibilidad (10-50 pg /ml) <<< Bioensayo. No diferencia citoquinas activas de fragmentos inactivos.

ELISPOT ASSAY

BIOENSAYOS:
Ensayos muy sensibles ( 1 pg/ml) bioactividad y potencia.
TECNICAS: a.- Proliferacin Crecimiento cel. Blanco susceptibles ( IL-1,2,3,4,5,6,7). b.- Citotoxicidad Muerte o inhibicin del crecimiento de cel. Blanco susceptibles ( TNF L929, IL-1 A375). c.- Diferenciacin de cel. Blanco susceptibles ( CSF, IL-3 crecimiento sobre agar suave; INF- ( expresin de MHC clase II, fagocitosis macrfagos). Desventajas: Dificil de realizar, mayor tiempo( dias a semanas) y <<especificidad.

Cel. Viables
Cuidadosos controles

Multiples Citoquinas compartiendo actividad