EL DNA y su extraccin

Dra. Mnica Saldarriaga

El aislamiento de DNA es necesario para anlisis genticos, y es usado para propsitos mdicos, cientficos, o forenses

Cientficos: Introduccin de DNA dentro de clulas animales y de plantas, identificacin de especies, anlisis poblacionales, estudios de conservacin, etc

Medicina: Diagnstico de enfermedades, terapia gnica.

Ciencias forenses: para identificacin de individuos, determinacin de paternidad, etc

Relevancia del Aislamiento del ADN

La extraccin de ADN es el primer paso en la tecnologa del ADN. Determinacin del perfil de ADN Clonacin Diagnstico de enfermedades Determinacin de secuencias de ADN Transferencia gnica: Organismos Modificados Genticamente (OMG), agricultura, farmacutica Pruebas ambientales, bioterrorismo

Aislamiento del DNA

1) El tipo de tejido que se va a emplear como fuente de DNA.

Para seleccionar un tejido como fuente de DNA debe reunir dos condiciones:
a) contener gran cantidad de material gentico y b) poseer baja actividad de DNAasa

2) El tipo de DNA que se va a extraer

DNA nuclear

Organizacin del DNA mitocondrial en serpientes

13 genes que codifican para protenas. 22 genes tRNA

2 genes rRNA
2 regiones control

Dos grandes diferencias entre DNA nuclear y DNA citoplasmatico

Mitosis y Meiosis (mutaciones y recombinacin)

Transmisin bi-parental (fusion de gametos)

Solo Mitosis Transmisin mono-parental (solo mutaciones) (maternal)

3) El tipo de anlisis a realizar (RFLP, RAPD, AFLP, secuenciacin, etc).

Extraccin de DNA
Calidad Cantidad

Posibilidad de almacenarlo
por tiempo indefinido.
Conservar su estructura y

Depende del nmero y

estado de las clulas propias del tejido a estudiar

propiedades.

Reproducibilidad en
un buen mtodo de extraccin debe mantener la integridad fsica y bioqumica del DNA e incrementar sus rangos de pureza y concentracin

experimentos posteriores

Pasos indispensables en la extraccin de ADN

1. Ruptura de tejidos y paredes celulares.

Pulverizar el tejido a bajas temperaturas

2. Ruptura de membranas
Una vez el tejido es disgregado en clulas, se hace necesario romper las membranas celulares para liberar el DNA.

SDS, Triton o detergentes comerciales)

3. Inhibicin de enzimas que destruyen al ADN.

Como un mecanismo de defensa natural, las clulas contienen enzimas que destruyen al ADN ADNasas
Estas enzimas deben ser inactivadas para garantizar la calidad de las preparaciones de ADN

Mtodos fsicos

Mtodos qumicos
-Solventes orgnicos (fenol y cloroformo)

- Calor ( 65 C)

- Antioxi-dantes (Ditiothreitol y mercaptoetanol)

- Agentes quelantes (EDTA, EGTA) que capturan los iones magnesio necesarios para la funcionalidad de las ADNasas,

4. Extraccin de contaminantes
Contaminante
Polisacridos Lpidos y grasas

Tratamiento
Uso de detergentes Incubacin enzimtica (con lipasas). Uso de detergentes (SDS, Triton). Tratamiento con cloroformo, alcohol isoamlico Incubacin enzimtica (con proteasas). Extraccin con fenol y cloroformo. Uso de detergentes. Uso de alcoholes. Incubacin enzimtica (con ARNasa). Electroforesis. Cambios en el pH. Evaporacin a temperatura ambiente. Tratamiento con cloroformo y alcoholes. Uso de solventes orgnicos. Uso de etanol al 70%. Uso de soluciones acuosas con posterior centrifugacin.

Protenas

Pigmentos ARN

Alcoholes Compuestos fenlicos Detergentes Sales Slidos insolubles

Los procesos de extraccin, purificacin y almacenamiento del DNA deben mantener el pH ptimo y brindar una alta concentracin inica

CONOCIMIENTOS TECNICOS BSICOS PARA LA INTERPRETACIN DE LOS PROTOCOLOS DE EXTRACCIN

El moler una muestra, permite la separacin de las clulas y la

ruptura de sus membranas.

Las sales precipitan a las protenas. La precipitacin nos

permite separarlas de los otros componentes.

El calor acelera las reacciones qumicas, como por ejemplo, la

precipitacin de las protenas.

Los alcoholes precipitan al DNA. Si se utilizan helados en

muestras calientes, ocasionan un choque trmico a la muestra.

Los choques trmicos provocados al DNA, permiten el

enrollamiento de sus hebras y con ello la visualizacin directa.

Resumen extraccin de DNA

Break down the cell wall and membranes

Centrifuge to separate the solids from the dissolved DNA

Precipitate the DNA using isopropanol

Dissolve DNA

Wash the DNA pellet with Ethanol and dry the pellet

Centrifuge to separate the DNA from the dissolved salts and sugars

Resultados esperados en un laboratorio de investigacin

Extraccin bajo condiciones ptimas

1 kbp and 100 bp ladders

Genomic DNA of 5 species of cereals

Resultados esperados en un saln de clases

Ladder

Extraccin de DNA de diferentes tipos de cereales bajo condiciones no ptimas

Extraccin de ADN : Paso-a-Paso

1. Obtenga del instructor un tubo de 15 mL que contenga 3 ml de agua. Marque el tubo con sus iniciales. 2. Cuidadosamente mordisquee el interior de los cachetes por 30 segundos. No sirve de nada sacar sangre!
3. Tome el agua del tubo de15 mL, y con el agua enjuague por 30 segundos.

Pasos 1 4

Protocolo de Prctica de Laboratorio

4. Cuidadosamente escupa el liquido de regreso al tubo de 15 mL.

Pasos 5 6

5. Obtenga el tubo de bfer de lisis del puesto de trabajo y aade 2 mL de bfer de lisis a su tubo que contiene el extracto celular. 6. Cierre el tubo e invirtalo suavemente para mezclar los componentes. (No lo mezcle muy duro!). Observe su tubo Ve algunos cambios? Antelos.

Pasos 7 9

7. Obtenga el tubo de proteasa (marcado prot) de su puesto de trabajo. Aade 5 gotas de proteasa a su tubo. 8. Cierre el tubo y voltelo suavemente varias veces. 9. Coloque su tubo en la gradilla o en un beaker en el bao de agua y djelo incubar por 10 minutos a 50C.

Protocolo de Prctica de

Laboratorio

Extraccin y precipitacin de ADN

Por qu se lleva a cabo cada paso?

1. Coleccin de clulas El mordisqueo del interior de la boca, en combinacin con el enjuague de agua funciona para separar las clulas del epitelio alineando la boca. Es crtico recoger la cantidad suficiente de clulas.

2. Bfer de Lisis

Qu es el Bfer de Lisis?
CH3

50 mM Tris-HCI, pH 8.0 1% SDS Bfer deTris para mantener el pH de la solucin en el cual ADN se mantiene estable 1% SDS para romper y abrir las membranas celulares y nucleares permitiendo que el ADN quede libre en la solucin.
O

CH2 CH2
CH2

CH2
CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2

S -

Na+

SDS

El detergente SDS desnaturaliza y desdobla las protenas dejndolas accesibles para las proteasas.

CH2

 La proteasa se utiliza para destruir las protenas nucleares que crean un enlace con el ADN y para destruir enzimas citoplasmticas que degradan y destruyen el ADN.

3. Por qu utilizamos la proteasa?

El tratamiento con proteasa incrementa la cantidad de ADN intacto que es extrado.

 La solucin de proteasa ya contiene sal. Los iones de Na+ del NaCI forman enlaces con los grupos de fosfato de las molculas de ADN, neutralizando las cargas elctricas del ADN. La adicin de NaCI permite que las molculas de ADN se junten en lugar de repelerse una a la otra. De esta manera se facilita la precipitacin del ADN de la solucin al aadir el alcohol.

4. Adicin de la solucin salina

La Estructura del ADN

Na+ Na+

P O CH2

Base

O
Azcar

Slo se muestra una cadena de ADN.

Na+ Na+
O

O P

Base

O
CH2

O
Azcar

OH

El ADN no se disuelve en alcohol.

El aadir alcohol hace que el ADN se agregue y se precipite de la solucin. Las molculas del ADN precipitadas parecen un material fibroso, como los hilos blancos de una telaraa. Las burbujas microscpicas de oxgeno, que se generan al mezclar, se agregan al precipitarse el ADN.

5. Precipitacin del ADN con alcohol fro

Las burbujas visibles ms grandes, levantan el ADN fuera de la solucin y lo llevan de la fase acuosa a la fase orgnica (fase del alcohol).

Pasos 10 12

10. Lentamente aade 10 ml de alcohol fri manteniendo el tubo a un ngulo de 45. Este paso va a requerir de varias adiciones utilizando la pipeta de transferencia desechable. 11. Deje el tubo en posicin vertical en la gradilla, a temperatura ambiente y en reposo, durante 5 minutos Que ve? 12. Cierre el tubo y voltelo de lado y de regreso en posicin vertical, con mucho cuidado, unas 10 veces, hasta que las fases de agua y alcohol queden mezcladas y el ADN salga de solucin.