ANALISIS DE GONADOTROPINAS CORIONICAS HUMANAS (Prueba del embarazo)

Dr. Juan Manuel Parreo Tipian

PRUEBAS BIOLGICAS DEL EMBARAZO:

Aschhin y Zondek (1928) Friedman (1931) Bellerby (1934) Frank y Perman (1941) Galli Mainini (1948) Wide y Gemzell (1960) Robbins y col. (1962) Wide (1969)

Reaccin de Friedman:
Conejas vrgenes de 14 a 16 semanas de edad. Se inyecta 2 dosis de 10 mL de orina a intervalos de 24 horas en la vena marginal de la oreja de la coneja. Despus de 48 horas se sacrifica al animal. .

Positivo: presencia de folculos hemorrgicos y de cuerpos lteos en uno o en ambos ovarios, que se presentan grandes e hipermicos. Negativo: No experimentan modificaciones

Reaccin de Galli Mainini:

Se utiliza sapo macho adulto. Se inyecta 10 mL al sapo en el saco linftico y despus de 1 a 4 horas se extrae material de la cloaca con un cuentagotas o una pipeta fina. Se observa al microscopio.

POSITIVO: presencia de espermatozoides.

PRUEBAS INMUNOLGICAS:

PREGNOSTICON:
Se basa en la presencia de la orina de la mujer

embarazada de HCG que estimula la presencia de Ac especficos demostrables in vitro. Se basa en la inhibicin de la aglutinacin de las partculas de ltex, que recubiertas con HCG sirven como Ag capaz de reaccionar con un suero inmune anti-HCG (de conejo).

Anlisis de hCG en lugar de prueba de embarazo. Se mide la presencia de hCG y no la presencia de un feto.

hCG
Es una glucoprotena formada por dos polimeros unidos por enlaces no covalentes: las subunidades alfa y beta. Cada subunidad aislada carece de actividad biolgica pero la adquiere al unirse formando dmero. Pico de concentracin se produce al final del primer trimestre.

hCG

Las cantidades polipeptdicas contienen cantidades variables de hidratos de carbono, como Dgalactosa, D-manosa y cido acetilneuramnico, siendo este ltimo esencial para la actividad biolgica de la hormona.

hCG

La subunidad alfa-HCG es idntica a la cadena alfa de otras hormonas polipeptdicas hipofisarias, como la TSH, FSH y LH.

La subunidad beta es la que otorga a cada una de estas hormonas sus caractersticas biolgicas especficas.

hCG

La hCG se sintetiza en las clulas sincitiotrofoblsticas de la placenta durante la gestacin. 8 a 10 das de la concepcin aparece la hCG. Entre la 8 y 10 semanas de gestacin la sntesis de beta-hCG alcanza su mxima actividad. Se detecta en la orina de la mujer embarazada entre 26 y 36 das despus del 1 da de la ltima menstruacin. La produccin de beta-hCG aumenta de forma progresiva en funcin de la masa de la placenta.

En el varn y en las mujeres no gestantes, se observan pequeas cantidades de esta hormona que son de origen hipofisario y tienen secrecin pulstil.

Al momento del primer atraso de la menstruacin, la concentracin del HCG es del orden de 100 mUI/mL.

Valores de 100,000 a 200,000 mUI/mL hacia el final del primer trimestre.

hCG

Durante las primeras semanas de la gestacin, la hCG tiene una doble funcin:
1. Estimular la formacin del cuerpo lteo, que es donde se produce progesterona 2. Estimular la esteroidognesis placentaria, cuando la actividad placentaria alcanza su completo desarrollo entre los 35 y 47 das tras la ovulacin.

Mtodos de anlisis de hCG

Mtodos cualitativos: Bioanlisis o anlisis biolgicos Anlisis de receptor Anlisis de inhibicin de la aglutinacin Anlisis Inmunoqumicos -Mtodos en placa -Mtodos en tubo Pruebas de concentracin: variaciones de enzimoinmunoanlisis de tipo sandwich. Limite de sensibilidad: 25-50U/L

Mtodos de anlisis de hCG

Mtodos cuantitativos:
-

Suero sanguneo La determinacin en funcin de los anticuerpos monoclonales utilizados: RIA anti-beta hCG Sandwich anti-beta hCG Sandwich anti-alfa hCG Otros.

Las tcnicas sandwich que se utilizan son IRMA o IEMA. Limite de deteccin: 2U/L. Diagnstico de la gestacin: cuando ha transcurrido alrededor de una semana desde la primera falta (50U/l) Diagnosis de gestaciones anmalas Diagnstico o monitorizacin de pacientes con neoplasma trofoblsico gestacional u otros tumores productores de hCG

Mtodos de anlisis de hCG

Primeras 8 semanas de embarazo: la cc de hCG en suero materno aumenta de forma geomtrica. Alcanzan un mximo de 100 000 U/L entre la octava y la dcima semana. Posteriormente la cc de hCG comienza a declinar lentamente tanto en suero como en orina para disminuir un 90% al final del segundo semestre.

Las cc de hCG en gemelares se duplican.

las

gestaciones

GESTACIN: suele fecharse en semanas comenzando desde el primer da de la ltima menstruacin. Embarazo de gestacin normal: 40 semanas (38-42 semanas).

FECHAS OBSTTRICAS: Son aproximadamente 2 semanas ms que las fechas embriolgicas. Paciente estar embarazada de 6 semanas.

Aplicaciones clnicas:
1.

2.
3. 4.

Diagnstico del embarazo. Pronstico de un posible aborto (prueba cualitativa). Mola hidatiforme Coriocarcinoma: Cncer del tej. Trofoblstico (mujeres). Tumor testicular (varones).

PARA EL DIAGNOSTICO DEL EMBARAZO: Se mide 8 a 9 das despus de la ovulacin poco tiempo despus del anidamiento del blastocisto en el endometrio. Alcanza su valor mximo 10 a 12 semanas de la gestacin (25,000 UI/L). Concentraciones menores 16 a 20

Tumor testicular: - Anlisis inmunohistoqumicos - Anlisis del PSA - Anlisis de HCG y AFP - Anlisis de PCR - Anlisis de microscopia electrnica.

METODOS EN EL LABORATORIO
Inmunoensayos Prueba de aglutinacin directa Prueba de aglutinacin indirecgta Ensayo inmunoenzmtico (ELISA)

PRUEBA DE AGLUTINACIN DIRECTA

Muestra: Orina Reactivos: Reactivo Ltex-anti-hCG: Suspensin de partculas de ltexpoliestireno que tienen adsorbidas molculas de anti-hCG.

Fundamento: La muestra se pone en contacto con un reactivo de ltex sensibilizado con anticuerpos monoclonales anti-hCG. Si la muestra contiene hCG, sta se unir en forma sensible y especfica producindose una aglutinacin visible macroscpicamente.

TECNICA CUALITATIVA: Colocar en una placa de vidrio de fondo oscuro: 1 gota de muestra 1 gota de reactivo latex anti-hCG

Mezclar durante 4 a 5 segundos hasta obtener una suspensin uniforme en toda la superficie del sector. Balancear suavemente la placa y observar macroscpicamente dentro de los 2 minutos.

Positivo: Aglutinacin Negativo: Suspensin homognea.

TITULACIN: Mezclar la orina recolectada durante 24 horas. Medir su volumen. Tomar una alicuota y procesar como sigue: a. Preparar diluciones sucesivas: , , 1/8, etc. b. Ensayar cada dilucin segn la tcnica cualitativva.

Clculos: 1. UI de hCG/mL = S x T donde: S= sensibilidad de la reaccin : 0,2 UI/mL de hCG T= ttulo. 2. UI de hCG/24 horas = S x T x V V= volumen total (en mL) de orina excretada durante las 24 horas.

VALORES DE REFERENCIA: Durante el primer trimestre del embarazo se observan valores de hCG entre 25-50 UI/mL, pudiendo llegar a un mximo de 250 UI/mL en condiciones normales.

AGLUTINACIN INDIRECTA

REACTIVOS: 1. Latex- Antgeno HCG: partculas de latex recubiertas covalentemente con HCG. 2. Suero Anti HCG: Antisuero de HCG.

FUNDAMENTO: Cuando la orina de una mujer embarazada se mezcla con el suero anti HCG, antes de la adicin del HCG- latex, el HCG presente en la orina neutraliza el anti- HCG de tal modo que la aglutinacin con las particulas de HCGlatx no se realiza. Por lo tanto una ausencia de aglutinacin es indicativo de un resultado positivo (presencia de HCG en la orina).

 PROCEDIMIENTO:

1. Colocar 1 gota de orina en la lamina. 2. Agregar 1 gota de suero anti-HCG sobre la gota de orina. Mezclar y ladear la lmina suavemente durante 30 segundos. 3. Agita el frasco de anti HCG (ltex), agregar 1 gota a la mezcla que se encuentra en la lmina. Mezclar y ladear la lmina lenta y suavemente por no ms de 2 minutos. -Examinar presencia de aglutinacin.

Interpretacin: Aglutinacin: Negativo No aglutinacin: Positivo.

PROCEDIMIENTO SEMI CUANTITATIVO: Colectar orina de 24 horas (V) Se separa una alicuota de aproximadamente 2 mL. Preparar diluciones progresivas de la orina utilizando suero salino: 1:2, 1:4,

La cantidad de HCG es derivada de la frmula siguiente: UI/mL = S x D

S = sensibilidad de la prueba (0,35 UI/mL). D= inversa de la dilucin que produce un resultado positivo.

UI/24 horas = S x D x V

PRUEBA INMUNOENZIMATICA PARA LA DETERMINACIN CUALITATIVA DE LA HORMONA GONADOTROFINA EN ORINA O SUERO.

PRUEBA INMUNOENZIMTICA PARA LA DETECCIN DE LA SUB-UNIDAD BETA DE HCG EN SUERO Y ORINA

Fundamento: Tipo sndwich La muestra es incubada con el conjugado enzimtico y los anticuerpos unidos a la fase slida simultneamente. En presencia de hCG, se forma un complejo que queda unido a la pared del pocillo. Una vez eliminado el conjugado enzimtico no ligado el pocillo es incubado con el sustrato.

 El desarrollo de un color azul indica la presencia de hCG en la muestra.