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TCNICAS DE BIOLOGIA MOLECULAR

Profa. Msc. Vanessa Carvalho Moreira

PCR - Polymerase Chain Reaction

Reao em cadeia da polimerase.


Inventado por Kary Mullis em 1983. Procedimento bsico de todo laboratrio de gentica molecular. Princpio: fazer um nmero imenso de cpias de um fragmento gnico (amplificao). - os produtos de amplificao da PCR so chamados de amplicons.

necessrio ter um conhecimento prvio da seqncia dos genes a serem amplificados. A sntese se desenvolve sempre no sentido 5 3. A PCR permite a amplificao de qualquer seqncia de DNA coletada de amostras de materiais biolgicos. - sangue, urina, outros fluidos corporais, cabelo e fragmentos teciduais - amostras de microorganismos, clulas vegetais ou animais com milhares de anos

Reagentes Necessrios para a Reao

A reao SEMPRE parte de: um DNA molde, extrado da amostra ou uma amostra de RNA, convertida para cDNA (DNA complementar).

O DNA deve estar livre de impurezas (como protenas, lipdeos, outro cido nuclico, reagentes de extrao, etc.) e em uma concentrao mnima de 5g/mL.

DNA polimerase A mais utilizada a Taq polimerase extrada da bactria Thermus aquaticus (carter termoestvel e capaz de sintetizar DNA a partir de seus precursores no sentido 5 3). Normalmente, so fornecidas com uma soluo-tampo que contm diversos ons (Na+, Cl-, K+, entre outros) que otimizam as condies de reao.

Protenas estabilizantes como BSA (Albumina Srica Bovina) Agem na denaturao da cadeia molde de DNA, quebrando as pontes de hidrognio entre as bases.

Magnsio (MgCl2) Cofatores indispensveis para atividade da enzima.

dNTPs (desoxinucleotdeos) Matria-prima para a sntese das fitas-filhas. Compostos por nucleotdeos (ATP, TTP, CTP, GTP) adicionados pela polimerase complementar fitame.

Primers Fitas de DNA com 20 bases (A, T, C, G) complementares criados em laboratrio. Na amplificao as fitas de DNA so separadas. Cada fita servir de molde para a duplicao, assim, precisa-se de dois tipos de primers (um para sintetizar a seqncia no sentido 3- 5- reverse e outro para o sentido 5-3- forward).

Uma PCR feita no termociclador: Bloco aquecido, controlado por um sistema digital, que eleva e abaixa a temperatura do material nele inserido (tubos de ensaio pequenos, micro-placas de 96 poos, etc), de acordo com a programao digitada pelo operador.

Como funciona a tcnica?

Em um tubo de ensaio ou placa de ensaio so adicionados um pouco de DNA contendo o trecho que quer amplificar, os dNTPs, a Taq pol e dois primers de DNA.

So colocados em um termociclador.
O material vai passar por 3 etapas diferentes: Desnaturao (92 -96C) Anelamento (35-60C) Extenso (72-76C)

Desnaturao (92 -96C)


Ocorre o desenrolamento da fita dupla do DNA, Quebra das pontes de hidrognio entre as bases, Origem de duas fitas simples de DNA.

Anelamento (35 -60C)

A temperatura rapidamente reduzida e os primers se ligam s suas seqncias homlogas correspondentes no DNA. O tempo necessrio de 30-45 segundos.

Extenso (72-76C)

A enzima taq polimerase realiza a extenso a partir de cada terminal 3 dos primers, Ocorre a adio de nucleotdeos utilizando como molde a sequncia alvo, surgindo uma cpia desta sequncia. Estimativa de tempo: para cada 1000 nucleotdeos atribumos 1 minuto ou 60 bases/s.

Este ciclo repetido por algumas dezenas de vezes.

A amplificao permite iniciar com quantidades mnimas de DNA e terminar a reao com grandes quantidades de DNA de uma sequncia especfica de interesse. Todos os testes so feitos em duplicata: evita erro da Taq polimerase por adio de base errada em uma das fitas. Consequncias podem ser trgicas no diagnstico gentico. Aconselha-se: deixar o tubo com os reagentes por 5 a 10min a 94 oC antes de iniciar o ciclo (garante que todo o DNA alvo esteja desnaturado antes de se iniciar o ciclo). ao terminar a ltima extenso manter na temperatura de 72 oC por mais 5 a 10min (garante que todas as fitas tenham o mesmo comprimento).

APLICAES DA PCR

Estudo do padro de expresso gnica (transcritos raros); Sequenciamento direto de produtos amplificados; Deteco de mutaes em genes especficos; Estudos diagnsticos de doenas infecciosas, deteco de bactrias, vrus e protozorios parasitas; Diagnstico de enfermidades genticas e na identificao de portadores sos de alelos mutantes; Elucidao de relaes evolutivas entre espcies, utilizando material arqueolgico; Investigao de Paternidade e Crimes;

Vantagens:

Rapidez, versatilidade e sensibilidade

Problemas:

Contaminao de reagentes e pipetas com amplicons. Necessidade de conhecer previamente a sequncia a ser amplificada para que se possa sintetizar os primers complementares.

TIPOS DE PCRs
PCR-RFLP (Polimorfismo no comprimento de fragmentos de restrio)

O material amplificado submetido a ao de enzimas digestivas que cortam o DNA em posies constantes dentro de um stio. Compara o perfil de um gene conhecido com o perfil de outros organismos.

O resultado obtido pela anlise dos fragmentos de diferentes tamanhos adquiridos.


Para detectar o polimorfismo, necessrio que as sequncias de nucleotdeos nas fitas de DNA a serem comparadas sejam distintas.

RAPD-PCR

Amplificao simultnea de vrios locos annimos no genoma utilizando primers de sequncia arbitrria.

Elimina a necessidade do conhecimento prvio de sequncia. Gera amplicons com diferentes tamanhos. Utilizao: anlise genmica de indivduos e populaes;

Caractersticas: tcnica rpida e de baixo custo.

dificuldade em reproduzir exatamente os mesmos resultados (o processo extremamente sensvel a pequenas diferenas de temperatura).

DNA extrado de indivduos de trs populaes distintas de insetos (a,b,c), (d,e) e (f,g,h). Os indivduos i e j no tinham origem determinada e poderiam pertencer a qualquer um dos trs grupos. A semelhana do padro de bandas com o primeiro grupo sugere a origem.

RT-PCR (Reverse Transcriptase Chain Reaction)

Reao composta de 2 partes: transcrio reversa amplificao propriamente dita

Nesta reao a amostra fornecida o RNA, que convertido em cDNA (DNA complementar) por meio da enzima transcriptase reversa. til em estudos de expresso gnica (ao avaliar o mRNA, podemos detectar quais protenas esto sendo efetivamente expressas).

Multiplex PCR

Mais de um segmento genmico amplificado em uma nica reao, cada um com seu par de primers especfico. Utilizado na investigao de paternidade, onde vrios marcadores genmicos devem ser analisados.

PCR Competitiva

So adicionados o DNA molde e um trecho de DNA com seqncia, tamanho e concentrao conhecidos (denominado controle), cujas extremidades so complementares tambm aos primers que iro amplificar a seqncia-alvo. So amplificados os dois trechos de DNA: a de interesse e a controle. Como sabe-se a quantidade de DNA na amostra controle possvel fazer a quantificao do DNA de interesse e assim dizer o quanto de DNA-alvo foi amplificado. Esta tcnica utilizada principalmente em kits diagnsticos (Carga Viral de HIV).

Real time PCR: PCR em tempo real

Ocorre a amplificao convencional de DNA, mas a deteco do resultado feita ao longo dos ciclos. utilizado uma molcula conhecida como SYBR green ou um oligonucleotdeo marcado (Taqman) que adicionado na reao Conforme a amplificao ocorre ao final de cada ciclo emitido um sinal fluorescente que captado por um sistema ptico e convertido em um grfico de amplificao. Nveis mais altos de sensibilidade so atingidos e o risco de contaminao se torna menor.

FIM