C

Enzimas implicadas en la Digestion Anaerobia de la materia organica

Maria Teresa Alvarez Aliaga Ph.D

Digestion Anaerobica
Protenas

Complejo de materia orgnica

Carbohidratos Lpidos HIDROLISIS Acidos grasos ACIDOGENESIS PRODUCTOS INTERMEDIARIOS, Ejm. Propionato, Butirato, etc ACETOGENESIS ACETATO H2 Y CO2 METANOGENESIS CH4 Y CO2

Aminoacidos Monosacaridos

Pared celular de plantas

Poliscaridos Celulosa Hemicelulosa Xilano

Lignina

Monosacridos

Sulfurogenesis
SO42-

BSR +

Fermentacin Acetato, propionato, butirato, valerato

H 2S

Digestion Anaerobica

Fermentacion Alcoholica

Lipidos y proteinas

Composicin del material vegetal

Problema: Microorganismos no pueden utilizar directamente substratos organicos complejos.

Muchos de los constituyentes de los substratos son polimeros de moleculas simples tales como azucares, aminoacidos, etc.

Celulosa es un polimero de D-glucosa

Hemicelulosa es un polimero de D-xilosa

Solucion: Enzimas extracelulares que degradan el sustrato a moleculas simples que son transportadas a traves de la pared celular. - Enzimas hidrolticas u oxidativas - Bateria de celulasas (enzimas hidrolticas) degradan celulosa a celobiosa o glucosa. - (Poli) fenol oxidasas (enzimas oxidativas) implicadas en la degradacion de la lignina.

Enzimas pueden ser inducibles o constitutivas Medicion de la actividad enzimatica

** Medicion de productos enzimaticos

Azucares reductores, cambios en pH ** Cambios en la concentracion de sustrato

** Depleccion de cofactores (ATP, NAD)

CH2OH C=O 6 CH2OH OH H C 1 O Carbono carbonilo CH2OH

O H
1 OH

C-OH
HO-C C-OH C-OH C-OH D-glucosa

(Alpha) O
OH

CARBONO ANOMERICO

1H

(Beta)

CH2OH O

CH2OH O

Celulosa
1 4 (n)

O
1 4

CHOOCH3 O CHOOCH3 O

Celobiosa (2 molec D-Glucose) Insoluble

O
1 4

CMC
Metil ester en Carbono 6 conferie carga + parcial Soluble

Hidrolisis Enzimatica
CH2OH O CH2OH O

HO
H 1

O
4

H
OH

H2O (H + OH) + Hidrolasa o enz hidrolitica

CH2OH O HO H OH H CH2OH O HO OH H

Enzimas Celuloliticas(Inducible)
CHOOCH3 O NR 4 1 CH2OH O CHOOCH3 O CH2OH O 1

O
4

O
1 4 1

O
4

(n)
n= 15,000

Cx1

C1

Cx2

C1 = 1,4- - glucan cellobiohidrolasa: rinde celobiosa NR Cx1 = 1,4- exoglucanasa: rinde D-glucosa NR

Cx2 = 1,4 - endoglucanasa: rinde dextrano Cx3 = 1,4 - glucosidasa: cliva celobiosa rinde 2 glucosas

Crystalline Cellulose

Swollen Cellulose

CMC

C1
Inhibiton

C1 + Cx

C1 Cx2 Cx2

C1

Cellobiose

Cx3
Random Dextrans
Inhibiton ??

Cx1 Cx3 C1 or Cx

D-Glucose
(Methyl if CMC)

HEMICELULOSA

HEMICELULOSA
- 1,4
O
NR HO 4 1 O 4 1

Xilosa es azucar reductor

O
O 4

O
OH 1 (n)

Exo

Endo

Productos: xilosa, xilobiosa (Exo) y xilanos de cadena corta (Endo). Xylobiasa hidroliza xilobiosa a dos residuos de xilosa. Medicion por azucares reductores (Exo) y cambio en la viscosidad

Background
AD of carbohydrates
Contents of cellulose, hemicellulose and lignin in common agricultural residues and other waste
Lignocellulosic material Corn cobs Grasses Paper Wheat straw Leaves Sorted domestic refuse Newspaper Solid cattle manure Sugar beet pulp (dried)
*

Cellulose (% dm*) 45 25-40 85-99 30 15-20 60 40-55 1.6-4.7 22-30

Hemicellulose (% dm) 35 35-50 0 50 80-85 20 25-40 1.4-3.3 24-32

Lignin (% dm) 15 10-30 0-15 20 0 20 18-30 2.7-5.7 3-4

dm dry matter

a) 25 20 15 10 5 0 0
b) 25 20 15 10 5 0 0 20 40 60 80

250 200 150 100 50 0 20 40 60 80

250 200 150 100 50 0

Endoglucanases, endoxylanase (IU l-1 )

-glucosidase, -xylosidase -1 (IU l )

c) 30 20 10 0 0
d) 30 20 10 0 0 20 40 Time (days) 60 80

250 200 150 100 50 0 20 40 60 80

250 200 150 100 50 0

5
Actividad enzimtica (UI/mL)

4
H2 S (mM)

0,007 0,006 0,005 0,004 0,003 0,002 0,001 0

Paja brava Hojas secas

3 2 1 0

10

15 Tiempo (Das)

20

25

30

Paja trigo Paja quinua

Paja avena Cascarilla arroz

10

15

20

25

30

Tiempo (Das)

a) Produccin de sulfuro

b) Actividad xilanolitica

ALMIDON

 1 4 Polimero de D-glucosa o Almidon Amilasas

CH2OH CH2OH CH2OH

O
NR HO O 1 4

O
O 1 4

O
OH (n) 1

1,4 exo glucanasa

1,4 endo glucanasa

D-glucosa

Maltosa y Dextranos
Amilases solo maltosa

I2KI

Amilopectina
CH2OH O O CH2OH O 1 O 1 6

CH2OH O HO 4
O 1 4

CH2OH O
O 1

6 CH2
O

OH 1
1,6 glucanasa

Pectina - Enzimas pectinoliticas o pectinasas

Enzimas pectinoliticas:
Enzimas maceradoras : Degradan la lamela media (cemento que une las celulas)

COOH O HO OH

Acido Galacturonico uidad basica de pectina

COOH
O
*

CHOCH3
O

COOH
O

HO
NR

O
1 4

O
1 4

OH (n)
Bateria de 9 enzimas hidroliticas

Inducible

1,4 acido galacturonico acido poligalacturonico

Pectin Metil Esterasa (PME pH = 9.0)

COOCH3 O
*

COOCH3 O

COOCH3 O

HO NR

OH (n)

+ Agua
Productos: acido Poligalacturonico y Metanol Medicion de actividad enzimatica Cromatografia de gases

Pectin Metil Transeliminasa (PMTE) pH = 9.0

COOCH3 O
*

COOCH3 O

COOCH3 O

HO NR

OH (n)

Exo

Endo

Productos son acido galacturonico (Exo) y productos de cadena corta (Endo). Medicion por azucares reductores y cambio en la viscosidad.

Poligalacturonico Transeliminasa (PGTE) pH = 9.0

COOH O
*

COOH O O
*

COOH O O OH (n)

HO NR

Exo

Endo

Productos: ac. Galacturonico (Exo) (Cambio en pH) y cadenas cortas de polimeros poligalacturonicos acidos (Endo) (Cambio en la viscosidad) .

Poligalacturonasa (PG) pH = 5.0

COOH O
*

COOH O O
*

COOH O O OH (n)

HO NR

Exo

Endo

Productos: ac.Galacturonico (cambios en pH) (Exo) y Polimeros de cadena corta de ac galacturonico (Cambios en la viscosidad (Endo).

Pectin Metil Galacturonasa (PMG) pH = 5.0

COOCH3 O
*

COOCH3 O

COOCH3 O

HO NR

OH (n)

Exo

Endo

Productos: Ac galacturonico metilado (Azucares reductores) (Exo) y cadenas cortas de polimeros metilados de ac. galacturnico (Endo).

Determinacion de azucares reductores

Muestra

Sustrato

Agua

Blanco Control

450 uL 450 uL

50 uL

Test

50 uL

450 uL

Incubar a 50 C por 60 minutos Muestra DNS

Blanco Control Test 50 uL

750 uL 750 uL 750 uL

Proteasas

Lipasas
Esqueleto de glicerol con cadenas esterificadas de acidos grasos CH2 CH2 CH2 O O O AG AG AG

Lipasa + Agua

R COOH CH2 OH CH2 CH2 OH Glicerol OH

R COOH R COOH Acidos grasos libres

AD of lipids
Fatty acid composition in various common oils, fats and wastewater expressed as the % of the total LCFAs (w/w).
Acid Structure* Olive Oil1 Palm oil1 Soya bean oil1 1.0 11.0 4.8 21.9 49.0 Cotton seed oil1 1.4 25.7 1.0 2.9 15.2 51.9 Whole milk2 Beef tallow
1

Lard3

Raw sewage1

Domestic wastewater4

Lauric Myristic Palmitic Palmitoleic Stearic Oleic Linoleic

*

12:0 14:0 16:0 16:1 18:0 18:1 18:2

14.3 1.4 2.4 71.4 5.5

1.4 42.9 0.7 4.8 39.0 10.0

7.0 6.0 21.0 2.0 6.0 39.0 13.0

1.0 2.6 28.1 3.8 20.0 37.6 2.9

1.0 28.0 3.0 13.0 46.0 6.0

27.6 16.7 48.3 5.1

2.2 16.4 0.9 8.1 30.5 29.2

Number of carbon atoms:number of double bonds

Muchas gracias!!!