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n
(
v
)
Km
Vmax
Vmax/2
La Km es la concentracin de sustrato
donde se obtiene la mitad de la Vmax
Concentracin de Sustrato [S]
V
e
l
o
c
i
d
a
d
d
e
l
a
r
e
a
c
c
i
n
(
v
)
Km
Vmax
Vmax/2
A mayor Km, menor es la afinidad de la enzima por el sustrato
A menor Km mayor es la afinidad de la enzima por el sustrato
Representacin directa
s
0 20 40 60 80 100
v
0
20
40
60
80
100
K
m
V
max
v
V s
K s
mx
m
=
+
Representacin recproca doble
(Lineweaver - Burk)
1/s
-0.4 -0.2 0.0 0.2 0.4 0.6
1/v
0.00
0.01
0.02
0.03
0.04
1 1 1
v
K
V s V
m
mx mx
= +
-1/K
m
1/V
max
Representacin Lineweaver-Burke
Representacin s -s/v
(Eadie - Hofstee)
s
-20 0 20 40 60 80 100 120
s/v
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
s
v V
s
K
V
mx
m
mx
= +
1
-K
m
Representacin Hanes
Representacin v/s - v
(Wong - Hanes)
v/s
0 2 4 6 8 10 12 14 16
v
0
20
40
60
80
100
v K
v
s
V
m mx
= +
V
max
Representacin de Eadie-Hofstee
Mtodos de linealizacin para determinacin
parmetros cinticos
Mtodo Eje Y Eje X Intercepto
Eje Y
Intercepto
Eje x
Pendiente
Lineweaver-
Burke
1/v 1/s 1/V -1/K K/V
Hanes s/v s K/V -K 1/V
Eadie-
Hofstee
v v/s V V/K -K
Definicin Actividad Enzimtica
Es el nmero de moles de sustrato que
reaccionan para formar producto, por mol de
enzima y por unidad de tiempo. Esto supone
que la enzima est plenamente saturada con
sustrato y por tanto que la reaccin se efecta
con su mxima rapidez
El ndice de recambio muestra la eficiencia
impresionante de la catlisis enzimtica
A fin de normalizar la medicin de la actividad, se ocupa el valor de
la velocidad inicial de reaccin, donde eses factores son
despreciables. As,
Esta velocidad inicial no se espera que sea observada en un proceso
enzimtico donde, debido a los elevados tiempos de operacin, es
razonable suponer que esos factores ejercern su influencia.
0 0
0
|
.
|
\
|
=
|
.
|
\
|
= =
t t
t
dt
ds
dt
dp
v a
Clculo de Actividad Enzimtica
La velocidad de reaccin catalizada por 0,1ml
de una dilucin 1:100 de Fosfatasa Alcalina es
0,3umoles / min. de producto. Cul es su
actividad enzimtica?
0,1ml-------- 0,3umoles producto / min.
1,0ml------------3,0umoles producto / min.
dil 1:100-------------300umoles producto / min.
Respuesta: 300U/ml
Nmero o ndice de Recambio
Es til definir una constante de velocidad ms
general, k
cat
, para describir la velocidad
limitante de cualquier reaccin enzimtica a
saturacin
k
cat
x E
t
= V
mx
V
0
= k
cat
x E
t
x [S] / K
M
+ [S];
K
cat
es una constante de velocidad de 1
er
orden con unidades de tiempo
-1
, tambin
llamada Nmero de Recambio
Efecto del pH en la ENZIMA
Cada enzima tiene un pH ptimo para su actividad
El pH afecta las interacciones inicas
1. Sobre la fijacin del substrato al centro activo:
- Grupos disociables de la enzima
- Grupos disociables del substrato
2. Sobre la transformacin cataltica del substrato
3. Sobre la estructura de la protena enzimtica
Efecto del pH
En el efecto de la temperatura hay dos componentes:
1. Aceleracin de la reaccin segn la ecuacin
de Arrhenius
k = A exp (-E
a
/RT)
2. Desnaturalizacin trmica de la protena
Efecto de la temperatura en la ENZIMA
Cada enzima tiene una temperatura ptima.
Temperatura
15 40 75
Aumento de la
velocidad
Desnaturacin
por calor
ORGANISMOS TERMFILOS
Son organismos que viven a altas t y realizan
sus reacciones enzimticas a estas altas t
Ejemplos son los que viven en las aguas
termales
Es tema de investigacin el aislamiento de las
enzimas de estos organismos para desarrollar
procesos industriales en condiciones ms
extremas
Coenzimas
Las coenzimas son pequeas molculas
orgnicas, que se unen a la enzima.
Las coenzimas colaboran en la reaccin
enzimtica recibiendo transitoriamente
algn grupo qumico: H
+
, OH, CH
3
.
La enzima sin la coenzima recibe el nombre
de APOENZIMA
El NAD es una coenzima aceptora de H
Sustrato
oxidado
Algunas enzimas requieren metales para
mejorar su actividad
Isoenzimas o Isozimas
Son formas moleculares diferentes de una
misma enzima
Catalizan la misma reaccin
Ejemplo: Lactato deshidrogenasa
Lactato + NAD ==== Piruvato + NADH
M
4
, M
3
H
1
, M
2
H
2
, M
1
H
3
y H
4
Se diferencian por su movilidad electrofortica
Usadas en clnica: sueros normales y sueros
con alguna patologa
As esta actividad corresponde al mximo potencial
cataltico que las enzimas poseen para un determinado
conjunto de condiciones ambientales. Luego, estas
deben ser consideradas en las expresiones matemticas
representativas del proceso enzimtico.
Existen situaciones (sustratos heterogneos) donde la
velocidad inicial de reaccin no es representativa del real
potencial cataltico de la enzima.
Se asume que la velocidad inicial de reaccin es
proporcional a la concentracin de protena enzimtica.
Inhibicin enzimtica
Inhibidor:
Efector que hace disminuir la actividad enzimtica, a travs de
interacciones con el centro activo u otros centros especficos
(alostricos).
Esta definicin excluye todos aquellos agentes que inactivan a
la enzima a travs de desnaturalizacin de la molcula enzimtica
De esta forma, habr dos tipos de inhibidores:
I. Isostricos: ejercen su accin sobre el centro activo
II. Alostricos: ejercen su accin sobre otra parte de la
molcula, causando un cambio conformacional con
repercusin negativa en la actividad enzimtica.
Inhibicin enzimtica
isostrica
Los inhibidores isostricos pueden ser de dos tipos:
1. Inhibidor reversible: establece un equilibrio con la enzima libre,
con el complejo enzima-substrato o con ambos:
E + I EI
2. Inhibidor irreversible: modifica qumicamente a la enzima:
E + I
E
ES + I
ESI
Inhibicin reversible
(a) El inhibidor se fija al centro activo de la enzima libre,
impidiendo la fijacin del substrato: Inhibicin Competitiva
(b) El inhibidor se fija a la enzima independientemente de que lo
haga o no el substrato; el inhibidor, por tanto, no impide la
fijacin del substrato a la enzima, pero s impide la accin
cataltica: Inhibicin No Competitiva
(c) El inhibidor se fija nicamente al complejo enzima-substrato
una vez formado, impidiendo la accin cataltica; este tipo
se conoce como Inhibicin Anticompetitiva
Inhibicin Competitiva
Inhibidores Competitivos
Compiten con el sustrato por el sitio
activo de la enzima
Se une solo a la enzima libre
V
mx
no se altera y K
M
cambia
Inhibicin competitiva
Al aumentar la cantidad
de SUSTRATO el
inhibidor competitivo es
desplazado y se forma
producto
E
ES
EI
I
S
E + P
Caractersticas:
- Las fijaciones de substrato e inhibidor son mutuamente exclusivas
- A muy altas concentraciones de substrato desaparece la inhibicin
- Por lo general, el inhibidor competitivo es un anlogo qumico del
substrato.
- El inhibidor es tan especfico como el substrato
Se define una constante de
equilibrio de disociacin del
inhibidor:
K
i
=
[E] [I]
[EI]
En condiciones de equilibrio rpido, llamando y a la concentracin
del complejo EI, para la inhibicin competitiva obtenemos el siste-
ma de ecuaciones
v
V s
K
i
K
s
mx
m
i
=
+
|
\
|
.
| + 1
K
e x y s
x
K
e x y i
y
m
i
=
=
( )
( )
0
0
Que resuelto para x nos da
x
e s
K
i
K
s
m
i
=
+
|
\
|
.
| +
0
1
De donde
Por tanto, en la inhibicin competitiva,
1. El efecto cintico del inhibidor es el aumento aparente de la
K
m
, que aparece multiplicada por el factor (1 + i/K
i
)
2. La V
max
no aparece modificada; para concentraciones muy
altas del substrato, v = V
max
, igual que en ausencia de inhibidor
3. Cuanto ms pequeo sea el valor de K
i
mayor ser la potencia
del inhibidor competitivo.
Km
Sin
inhibidor
Km
con
inhibidor
Sin inhibidor
Con inhibidor
El inhibidor competitivo
aumenta la Km
1/s
-0.3 -0.2 -0.1 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6
1/v
0.00
0.01
0.02
0.03
0.04
0.05
0.06
0.07
-1/K
m
-1/(K
m
(1 + i/K
i
))
1/V
max
Inhibicin competitiva - Representacin recproca doble
Ejemplo Inhibidor Competitivo
cido succnico + FAD == cido
fumrico + FADH
2
El inhibidor competitivo es el cido
malnico
Es un anlogo estructuralmente
parecido al cido succnico
cido Flico y Sulfanilamida
La sulfanilamida es un anlogo estructural
del cido p - aminobenzoico (PABA)
PABA es el punto de partida para la sntesis
de cido flico en las bacterias
El cido flico es una vitamina esencial para
la proliferacin (divisin) bacteriana
Sulfanilamida se usa en el tratamiento
algunas infecciones
Metotrexato y Dihidrofolato
El cido flico en sus formas de dihidro y
tetrahidrofolato es coenzima de la reaccin
catalizada por la dihidrofolato reductasa
Esta reaccin es parte del metabolismo de
los nucletidos para la sntesis de DNA
Metotrexato se usa en la terapia de algunos
cnceres, inhibiendo la sntesis de DNA
Inhibidor competitivo
su estructura es similar a la del sustrato
No se forma producto
Inhibicin No Competitiva
Inhibidor No Competitivo
Se une a un lugar diferente del sitio
activo la enzima
Se une a la enzima libre y tambin al
complejo enzima-sustrato
Por accin del inhibidor disminuye la V
m
pero el valor de K
m
no se altera
Inhibicin NO competitiva
Inhibidor NO competitivo
El inhibidor NO competitivo se une a la enzima en un
sitio diferente del sitio activo
E ES
EI
I
S
E + P
I
ESI
S
Inhibicin
No Competitiva
El inhibidor se fija indistintamente a la enzima libre E
y al complejo enzima-substrato ES; ni el complejo EI
ni el complejo ESI son productivos
Inhibicin
Anticompetitiva o
Incompetitiva
Inhibidor Incompetitivo
En este tipo de inhibicin el inhibidor se enlaza al centro
activo pero solo despus de que el sustrato lo haya hecho y,
por tanto, inhibidor y sustrato no compiten. De esta manera,
aunque todo el sustrato est saturando la enzima y toda la
enzima est como complejo ES, el inhibidor puede
enlazarse produciendo un complejo inactivo ESI.
Como I solo se une a ES estimula la formacin de ES y, por
tanto, incrementa la unin del sustrato a la enzima,
disminuyendo Km . Sin embargo, el complejo ESI no
conduce a productos y Vm disminuye.
Inhibidor Incompetitivo
Se une a un lugar diferente del sitio
activo de la enzima
Se une slo al complejo enzima-sustrato
Los efectos que tiene: disminuye el valor
de K
m
y tambin el de V
mx
E ES
S
E + P
I
ESI
Inhibicin
Anticompetitiva
El inhibidor slo puede fijarse al complejo ES;
el complejo ESI no es productivo
Modelo Kap Vap
Inh comp Km(1+i/Ki) Vm
Inh no comp total Km Vm/(1+i/Ki)
Inh anticomp Km/(1+i/Ki)
Vm/(1+i/Ki)
Determinacin de parmetros cinticos de
inhibicin
Inhibicin Irreversible
- Los inhibidores irreversibles reaccionan con un grupo
qumico de la enzima, modificndola covalentemente
- Su accin no se describe por una constante de equilibrio K
i
,
sino por una constante de velocidad k
i
:
E + I E
- A diferencia de la inhibicin reversible, el efecto de los
inhibidores irreversibles depende del tiempo de actuacin
del inhibidor.
- Los inhibidores irreversibles son, por lo general, altamente
txicos.
Inhibidores Irreversibles
Producen inactivacin permanente de la
actividad enzimtica
Se interfiere con el normal desarrollo de
una reaccin o va metablica
Ejemplos: p-cloromercuribenzoato,
yodoacetato, diisopropilfluorfosfato
Algunos tipos de inhibidores irreversibles
1. Reactivos de grupos -SH
2. Organofosfricos
3. Ligandos de metales
4. Metales pesados
Inhibicin enzimtica
alosterica
Enzimas Alostricas
Son enzimas cuya estructura proteica est formada
de varias subunidades
No se rigen por la cintica de M - M
Adems del sitio o centro activo tienen sitios
alostricos o de regulacin
Sitio activo/sustratos;
Sitio alostrico/moduladores o reguladores
La relacin entre la velocidad de reaccin y la
concentracin de sustrato sigue cintica sigmodea
Enzimas alostricas
Las enzimas alostricas
presentan estructura
cuaternaria.
Tienen diferentes sitios
activos, unen mas de una
molcula de sustrato
La unin del sustrato es
cooperativa
la curva de velocidad
presenta una forma
sigmoidal
Concepto de Cooperatividad
La unin de los sustratos al sitio activo de
una subunidad produce un cambio
conformacional que por contacto fsico se
transmite a las subunidades vecinas,
facilitando las interacciones
Modelos de unin: secuencial y concertado
Ejemplos: unin Hb-O
2
, enzimas alostricas
y sus sustratos
Moduladores Alostricos
Tambin reciben el nombre de efectores
y pueden ser positivos o negativos
Se unen al sitio alostrico que puede
estar en la misma subunidad que tiene
al sitio activo o en las subunidades
regulatorias
Su unin produce un cambio
conformacional que afecta al sitio activo
Aspartato Transcarbamilasa
c L-asp + Carbamil-P === Carbamil-
asp + Pi . Primera reaccin en la sntesis
de pirimidinas
Efector positivo: CTP
Efector negativo: ATP
Tiene dos subunidades catalticas para
los sustratos y tres subunidades
regulatorias para los efectores
RESUMEN
Las enzimas son protenas que catalizan
las reacciones biolgicas
Presentan especificidad por su sustrato
Cada enzima presenta dos parmetros
importantes Vmax (saturacin de la
enzima) y la Km (medida de la afinidad
por el sustrato)
RESUMEN
La actividad enzimtica puede ser
inhibida, por inhibidores competitivos
(similares al sustrato) o por inhibidores
no competitivos.
La temperatura y el pH afectan a la
enzima en su actividad cataltica.
Algunas enzimas requieren de
coenzimas y/o cofactores para su
actividad.