Microbiologa General

Unidad 3

Bibliografa recomendada: Cap. 11 de la 8
edicin Biologa de los microorganismo
Tcnicas de eliminacin y de
conservacin de microorganismos.
Conceptos de esterilidad y asepsia. Inhibicin del crecimiento:
antibiticos y antispticos. Esterilizacin por calor. Cintica
de muerte: valores D y z. Lesin en los microorganismos.
Esterilizacin por otros tratamientos fsicos y qumicos.
Esterilizacin por filtracin.
Mtodos de conservacin de cultivos.
Algunos conceptos bsicos...
Esterilizacin: eliminacin o muerte de todos los
microorganismos que contiene un objeto o sustancia.

Asptico: cuando se han eliminado todos los microorganismos
patgenos. Un ambiente asptico no tiene porqu ser estril.



Inhibicin Del Crecimiento





Antispticos
Antibiticos Desinfectante
Clasificacin de Antibiticos
Espectro de accin : a) Procariontes
b) Eucariontes
c) Ambos grupos.
d) Antivirales

Modo de accin los antibiticos pueden ser
a)Bactericida
Segn su b)Bacteriosttico

Sitio de accin a nivel celular
a) Pared celular
b) Membrana celular.
c) Antibiticos que actan bloqueando la
sntesis de protenas


Cintica de Muerte de un MO
Esterilizacin
Criterio de muerte para un microorganismo


Perdida irreversible de su capacidad de
reproduccin
Se define como el tiempo necesario para que el nmero de supervivientes caiga al
10% del valor inicial (o, lo que es lo mismo, para que el logaritmo del nmero de
supervivientes se reduzca en una unidad).
VALOR D : Tiempo de reduccin decimal
Efecto de la Temperatura
l
o
g

n

m
.
o
.

v
i
a
b
l
e
s

tiempo
60 C
100
10
1
70 C
50 C
A que temperatura
es menor el valor de
D?
D es un parmetro de la sensibilidad de un Microorganismo
determinado al efecto de la temperatura
l
o
g

n

M
O

v
i
a
b
l
e
s

tiempo
B
100
10
1
C
A
Cul es el MO
ms sensible al
tratamiento?
Si aumentamos la temperatura de tratamiento, el valor de D disminuye de forma
logartmica. De manera anloga a como el valor D indicaba el tiempo necesario para
lograr que el nmero de supervivientes se redujera al 10% de la poblacin inicial, el
valor z indica el incremento en la temperatura (medida en nmero de grados)
necesario para que el valor D se reduzca a la dcima parte del inicial.
VALOR Z
donde T es el incremento
de temperatura, y D
T1
y
D
T2
los valores de D a las
dos temperaturas
estudiadas.
Destruccin de MO
Tipo de
agente
Tipo de
accin
Espectro de
agente
Uso
Eficacia de un agente
antimicrobiano
Concentracin de la Dosis
Tiempo de Accin
Tipo de MO
N de MO
Efecto de la Temperatura sobre caractersticas de los alimentos
Efecto de la carga inicial (No)
0
1
2
3
4
5
6
7
8
0 20 40 60 80
Tiempo (min)
l
o
g

N

s
o
b
r
e
v
i
v
i
e
n
t
e
s
6
5
4
3
2
1
0
5
4
3
6
2
1
1 2 3 4 5 6 7
Log
10
Tiempo
(min)
A
B
R
e
c
u
e
n
t
o

d
e

v
i
a
b
l
e
s

P
r
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a
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l
i
d
a
d

d
e

s
o
b
r
e
v
i
v
i
e
n
t
e
s

Log
10
0
Valor D=1 minuto
10
5

12
10
8
6
4
2
0
1 2 3 4 5 6 7
Log
10
Tiempo
(min)
R
e
c
u
e
n
t
o

d
e

v
i
a
b
l
e
s

P
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l
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d
a
d

d
e

s
o
b
r
e
v
i
v
i
e
n
t
e
s

Log
10
10
8
6
12
4
2
0
MO B
D=0.5 min a
121 C
MO A
D=1 min a 121 C
METODOS DE ESTERILIZACION
FISICOS

Calor

Radiaciones

Filtracin

Ultrasonido
QUIMICOS

Distintas sustancias:
- xido de etileno

-Glutaraldehdo

-Formaldehdo
MECANISMOS DE ACCION
1- Alterando el DNA:

2- Alterando protenas y enzimas

3- Alterando la membrana celular

1- DNA:


- radiaciones (UV, ionizantes)


_ alquilantes (glutaraldehdo,
formaldehdo y xido de etileno)











2- Protenas y enzimas:
Calor ; cidos y lcalis

Oxidantes : perxido de hidrgeno
Iodo
Metales pesados: mercurio


3- Membrana celular
Alcoholes
Fenoles
Agentes tensioactivos (amonios
cuaternarios, jabones, detergentes)

Calor
Calor hmedo


Calor seco


Ambos pueden ser
utilizados en procesos de
esterilizacin
Calor hmedo
PROCESOS

Esterilizacin:
Vapor saturado a presiones mayores que la atmosfrica
Tindalizacin (fraccionada por vapor)
Pasteurizacin
UHT

MECANISMOS DE ACCIN

Desnaturalizacin de protenas
Destruccin de cidos nucleicos

Pasteurizacin
LHT (low temperature holding)
30 minutos a 62.8C
HTST (high temperature short time)
15 segundos a 71.6C
Solo destruye patgenos (Coxiella burnetti, Mycobacterium
tuberculosis, etc.) y reduce flora de deterioro.
NO ES UN PROCESO DE ESTERILIZACIN
Usos: leche, lcteos, jugos de fruta
Louis Pasteur
UHT (Ultra high temperature)
140C-150C durante pocos segundos
Proceso continuo
Necesita envasado asptico
Si es un proceso de esterilizacin
Tindalizacin
100 C 30 min, 3 das sucesivos
Proceso discontinuo con perodos de incubacin intercalados
Usos: esterilizacin de productos de baja resistencia
trmica, cuando no existe otra opcin
John Tyndall
Vapor saturado a presiones mayores
que la atmosfrica

Condiciones: Vapor saturado a temperaturas mayores de
100C
(PRECAUCIN: eliminacin total del aire)

Equipo: Autoclave

Alcance: Se puede conseguir esterilizacin

Usos: Esterilizacin de materiales y productos termoestables
( salvo productos oleosos y polvos). Descontaminacin de
desechos biolgicos.




Autoclave
Condiciones :
121C durante 15 minutos, con cargas iniciales bajas
121C durante 30 minutos, con cargas iniciales altas

Indicadores:
Fsicos: Temperatura y/o presin
Qumicos
Indicador biolgico: Geobacillus stearotermophilus
(D
121C
=1.5 minutos)
Tamao del inculo: 10
4
esporas

Autoclave
Perfil de temperatura de un proceso
de esterilizacin por calor hmedo
T
e
m
p
e
r
a
t
u
r
a

C

100
110
120
15
Tiempo (min.)
Etapa de calentamiento Etapa de
mantenimiento
Etapa de enfriamiento
1 2 3
Calor Seco
Mecanismo de accin: Procesos de oxidacin

Controles de proceso de esterilizacin

Indicadores fsicos y qumicos

Indicador biolgico esporas de Bacillus subtilis var. niger
(D
160C
= 0.3 a 1.8 min, Z=20C, tamao del inculo: 10
5
esporas)
Calor Seco
Aire caliente:

Equipo:Hornos elctricos
Alcance: Se consigue esterilizacin (170C, 60 minutos o 160C, 120
minutos)
Usos:

a) Esterilizacin de:

Materiales resistentes al calor
Sustancias no miscibles en agua (inyectables oleosos, siliconas,
vaselina lquida)
Polvos

b) Despirogenizacion (250C 45 minutos o 180C 4hs, o 650 1 min)

Incineracin:
Destruccin de material
contaminado





Flameado :

Desinfeccin
Resistencia a calor

Priones
Endosporas bacterianas
Mycobacteria
Virus sin envoltura lipdica
Hongos
Bacterias
Virus con envoltura lipdica
RESISTENCIA
+
_
La esterilizacin por filtracin se logra por el paso de un lquido o un gas a
travs de un material capaz de retener los microorganismos presentes. La
esterilizacin por filtracin se emplea para materiales sensibles al calor, tales
como ciertos medios de cultivo, azcares, soluciones de antibiticos y otros
medicamentos, etc.
Esterilizacin por filtracin
Filtros de profundidad:
Estos filtros estn elaborados por un material
fibroso (papel, asbesto o fibra de vidrio) dispuesto
al azar, de manera que dentro de la estructura del
filtro se crean vas tortuosas donde pueden quedar
retenidos la mayora de los contaminantes
presentes.
Filtros de superficie:
Son filtros elaborados generalmente de acetato de
celulosa o nitrato de celulosa y contienen poros de
tamao uniforme. Este tipo de filtro tiene como
ventaja que, al conocer exactamente el tamao de
poro que presentan, se pueden seleccionar filtros
capaces de retener la totalidad de los
microorganismos presentes en una solucin. Sin
embargo, se saturan rpidamente y la velocidad de
filtracin a travs de ellos es lenta.
La mayor parte de los filtros de membrana se
pueden esterilizar en autoclave y luego se
manipulan aspticamente al ensamblar el equipo.
FILTRACIN DE AIRE
Filtros HEPA (High Efficiency Particulate Air)
Remocin de hasta el 99.97% de partculas mayores de 0.3 micrones de
dimetro
Se usan en cabinas o habitaciones de flujo laminar

CONTROL
Retencin Mnima de un 99.97% de partculas generadas mediante ensayo
DOP(di-octil-nftalato) en caliente con un dimetro de 0.3 micrones.

SE USAN PARA Lograr ambientes con nmero de partculas
controlado: FLUJOS LAMINARES
AREAS DE TRABAJO
Cabinas de Flujo Laminar
Vertical
Entrada
de aire
Salida de aire
Protege la
muestra, el
operador y el
medio ambiente
Actividad
antimicrobiana
Alta energa
Baja energa
Dos tipos: Radiaciones ionizantes
Radiaciones no ionizantes
Esterilizacin por radiaciones
Radiaciones Ionizantes
Caractersticas:
Alta energa, baja longitud de
onda
Gran poder de penetracin
Ionizan tomos y molculas
No requieren altas temperaturas
Tipos:
Rayos gamma (
60
Co o
137
Cs)
Rayos catdicos (electrones
acelerados)
Partculas beta
Mecanismos de accin:
Formacin de radicales libres
Dao al ADN, ARN

Resistencia:
Priones
Deinococcus radiodurans
Enterococcus faecium
Esporas bacterianas
Virus
Hongos
Bacterias (en gral)

D (kGy) m.o.
3 Bacillus pumilus
1.2 Staphylococcus spp.

Desventajas:
Equipo especial, personal entrenado
No todos los materiales resisten el tratamiento
Reacciones no deseadas en alimentos

Radiaciones no Ionizantes
Caractersticas:
Baja energa, sin poder ionizante
Sin poder penetrante
Mxima eficiencia biocida a 260nm

Mecanismos de accin:
Sitio blanco ADN
Formacin de dmeros de timina

Usos:
Desinfeccin de superficies
Desinfeccin de aire y agua
NO SE UTILIZAN
PARA
ESTERILIZAR
SINO PARA:
Luz ultravioleta
La radiacin ultravioleta producida artificialmente en el espectro de 250 nm ha
sido utilizada por su actividad germicida esterilizante por ms de 30 aos.
La accin de los rayos ultravioleta se debe a la produccin de ozono que logra la
asepsia, ya que este gas conserva su accin inhibidora hasta una dilucin de 1 x
40.000. Los aminocidos aromticos de las protenas y las bases puricas y
primidinicas, en particular la timina del DNA, son los principales compuesto
blancos afectados por la accin bactericida de la accin ultravioleta. Evitando la
replicacin de las tiras del DNA o causando recombinaciones que terminan en
mutaciones mortales.
Dmeros de timina
ESTERILIZACIN POR RADIACION UV
Procesos de esterilizacin
Usos Condiciones Agente
Material filtrable 0.22 micras de poro Filtracin
Material termosensible
Resistente al tratamiento
25KGy
45KGy
Radiaciones
ionizantes
Material termoestable
No penetrable por vapor
160C 2 horas
180C 1 hora
Calor seco
Material termoestable
Penetrable por vapor
121C 15 min.
(o equivalente)
Calor hmedo

Control de Esterilizacin
Controles del proceso
Indicadores: Fsicos
Qumicos
Biolgicos

Post-proceso:

TEST DE ESTERILIDAD !!!
Indicador fsico Ej: Temperatura, presin
Indicador qumico Cambio de color
Controles del proceso
Indicador biolgico Microorganismo resistente
Antispticos
Alcoholes
Iodo
rgano-Mercuriales
Colorantes

Desinfectantes y/o Esterilizantes
Cloro y Compuestos clorados
Aldehdos
Oxido de Etileno
Compuestos Fenlicos

Agentes qumicos de esterilizacin y
control del crecimiento


Lesionan la membrana celular de los microorganismos y desnaturalizan
protenas. Desorganizan la estructura fosfolipdica de la membrana.
No destruyen esporas y tienen una accin germicida lenta.
Los alcoholes de cadena corta tienen un efecto nocivo mayor que los de
cadena larga. Se utilizan en concentraciones del 50 al 70%.
Los ms utilizados son el etanol e isoproplico.


Es un agente oxidante que modifica grupos funcionales de protenas y cidos
nucleicos. Inactiva protenas y enzimas por oxidacin de los grupos -SH a S-S,
pudiendo atacar tambin grupos amino, indoles, etc.
Se utiliza como desinfectante de la piel (tintura de iodo: yodo molecular 2% y
yoduro de sodio 2% en alcohol), aunque es irritante.
Es efectivo contra esporas en una concentracin de 1600 ppm de
iodo libre
Iodo
Alcoholes


Es un antisptico dbil, con capacidad oxidante y formadora de radicales libres.
Actualmente, el perxido de hidrgeno gaseoso se est utilizando como
desinfectante de superficies o decontaminante de gabinetes biolgicos debido a
que no posee las propiedades txicas y cancerigenas del xido de etileno y
formaldehdo.
Estos tipos de compuestos se combinan con los grupos -SH de las protenas,
inactivando enzimas.
Dentro de los mercuriales orgnicos se encuentran el metafen y el mertiolate.
rgano-Mercuriales
Perxido de Hidrgeno
Los derivados del trifenilmetano (violeta de genciana, verde de malaquita y verde
brillante) bloquean la conversin del cido UDP-acetilmurmico en UDP-
acetilmuramil-pptido.
Colorantes
R = HSO
4
-
Verde Brillante
R = Cl
-
Verde de Malaquita
Violeta de Genciana

El cloro, los hipocloritos y las cloraminas son desinfectantes que actan sobre
protenas y cidos nucleicos de los microorganismos. Oxidan grupos -SH, y
atacan grupos aminos, indoles y al hidroxifenol de la tirosina.
El producto clorado ms utilizado en desinfeccin es el hipoclorito de sodio (agua
lavandina), que es activo sobre todas las bacterias, incluyendo esporas, y
adems es efectivo en un amplio rango de temperaturas.
La actividad bactericida del hipoclorito de sodio se debe al cido hipocloroso
(HClO) y al Cl
2
que se forman cuando el hipoclorito es diluido en agua.

El hipoclorito de sodio se comercializa en soluciones concentradas (50-100 g/l
de Cloro activo) y Generalmente, se utilizan soluciones con una concentracin
del 0.1-0.5% de Cloro activo.
Su actividad est influida por la presencia de materia orgnica
Cloro y sus derivados
Aldehdos
Son agentes alquilantes que actan sobre protenas, lo que provoca
modificacin irreversible de enzimas e inhibicin de la actividad enzimtica.
Se utilizan como desinfectantes y esterilizantes. Destruyen esporas.
El glutaraldehdo es el nico esterilizante efectivo en fro.
El formaldehdo como gas se utiliza para descontaminar edificios, ambientes,
etc.
El formaldehdo gaseoso se obtiene por calentamiento del paraformaldehdo
tiene la desventaja de ser muy irritante y perder actividad en ambientes
refrigerados.
Glutaraldehido Paraformaldehido Formaldehido

Es un agente alquilante que se une a compuestos con hidrgenos lbiles
como los que tienen grupos carboxilos, amino, sulfhidrilos, hidroxilos, etc.
Es utilizado en la esterilizacin gaseosa, generalmente en la industria
farmacutica. Sirve para esterilizar material termosensibles como el
descartable y plstico, equipos electrnicos, bombas cardiorrespiratorias, etc.
Es muy peligroso
Oxido de Etileno
Compuestos Fenlicos
Son desinfectantes que provocan lesiones en la membrana citoplasmtica
porque desordenan la disposicin de las protenas y fosfolpidos.
El fenol no es usado a menudo como desinfectante por su olor desagradable,
por ser muy irritante y por el resido que queda luego de tratar las superficies.
Los derivados del fenol ms utilizados son el hexaclorofeno (compuesto
difenlico) y los cresoles (alquil fenoles). Estos son muy efectivos a bajas
concentraciones contra formas vegetativas de bacterias. No son efectivos
contra esporas.
Coeficiente del fenol
BIOSEGURIDAD
Bioseguridad
Contencin primaria: proteccin del personal y del medio ambiente
inmediato del laboratorio de la exposicin a agentes infecciosos.

Contencin secundaria: Proteccin del medio ambiente externo al
laboratorio de la exposicin a materiales infecciosos

Equipos de Seguridad (Barreras Primarias). Los equipos de
seguridad incluyen gabinetes de seguridad biolgica (BSCs), recipientes
cerrados, y otros controles de ingeniera destinados a eliminar o minimizar
las exposiciones a materiales biolgicos peligrosos.

Diseo y Construccin de Instalaciones (Barreras Secundarias)

Riesgo Biolgico: Es la probabilidad de sufrir cualquier tipo de
infeccin, alergia, o toxicidad por una exposicin no controlada a agentes
biolgicos.
Niveles de Bioseguridad
Bioseguridad
Agentes de Riesgo
Bioseguridad
Se entiende por agente de riesgo biolgico cualquier
microorganismo -incluyendo de los genticamente
modificados- cultivo celular, animal o planta o producto
de estos, capaz de producir cualquier tipo de infeccin,
alergia o toxicidad en humanos, animales u otros seres
vivos.
Agentes de Riesgo - Grupo I
Bioseguridad
Sin riesgo o bajo riesgo individual y comunitario. Agentes
bien identificados que se sabe que no producen
enfermedad en humanos sanos y existe un potencial
mnimo de peligro para el personal del laboratorio y el
ambiente.

Bacillus subtillis
Naegleria gruberi
virus de la hepatitis canina infecciosa


Agentes de Riesgo - Grupo II
Bioseguridad
Riesgo individual moderado y bajo riesgo comunitario. Agentes
asociados con enfermedades en humanos, especialmente por
ingestin o exposicin percutnea o mucosa.
Patgenos que pueden producir enfermedad en humanos
animales pero es poco probable que sea un problema para los
trabajadores del laboratorio, la comunidad, los animales o el
ambiente. La exposicin en el laboratorio puede producir una
enfermedad seria pero existe tratamiento efectivo y las
medidas preventivas estn disponibles, el riesgo de dispersin
de la enfermedad es limitado.

Salmonella spp.
Virus de la Hepatitis B
Toxoplasma spp.
Bacillus anthracis
Bordetella pertussis

Agentes de Riesgo - Grupo III
Bioseguridad
Alto riesgo individual, bajo riesgo comunitario. Trabajo con
animales infectados con agentes exticos que tienen riesgo de
transmisin por aerosoles y pueden causar una enfermedad
seria o potencialmente letal.
Patgenos que usualmente causan serias enfermedades en
animales y humanos pero que comnmente no se propagan de
un individuo infectado a otro. Las medidas preventivas y de
tratamiento efectivo estn disponibles.


Brucella bortus
Coxiella burnetii
Mycobacterium



Agentes de Riesgo - Grupo IV
Bioseguridad
Alto riesgo individual y comunitario. Trabajo con agentes
peligrosos que tienen alto riesgo de amenazar la vida,
transmitirse por va area o que se desconoce su riesgo de
transmisin.
Patgenos que usualmente causas serian enfermedades en los
animales o los humanos y que pueden transmitirse de un
individuo de forma directa o indirecta. Usualmente no estn
disponibles ni medidas preventivas ni tratamiento efectivo.


Virus de Marburg
Ebola
Virus Junn

Gabinetes de seguridad biolgica
Clase I (Campana)
Bioseguridad
A. Apertura frontal
B. Ventana
C. Filtro de
Escape HEPA
D. Pleno de Escape
Gabinetes de seguridad biolgica
Clase II (Flujo Laminar)
Bioseguridad
A. Apertura Frontal;
B. Ventana;
C. Filtro de escape HEPA;
D. Pleno posterior;
E. Filtro HEPA de Suministro;
F. Ventilador
A. Apertura Frontal; B. Ventana;
C. Filtro de Escape HEPA; E. Pleno de Escape de
Presin Negativa; F. Ventilador; G. Filtro HEPA
adicional para enviar aire.
Gabinetes de seguridad biolgica
Clase III (Flujo Laminar)
Bioseguridad
A. Inserciones para guantes con aros circulares para instalarles guantes
del largo del brazo al gabinete;B. Ventana, C. Filtro de Escape HEPA; D.
Filtro HEPA de Suministro; E. Caja para Autoclave de Doble Extremo.
Transporte de material riesgoso
Bioseguridad