UNIVERSIDAD NACIONAL AUTNOMA DE MXICO.

FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES ZARAGOZA.

MICROBIOLOGA GENERAL II


PRCTICA
ESTRUCTURAS DEL EMBRIN DE POLLO Y SUS
VAS DE INOCULACIN.



OBJETIVO
1. Adiestrar al alumno en el manejo de la tcnica
de la inoculacin de embrin de pollo por las
vas ms utilizadas.
2. El alumno conocer las diversas partes del
embrin de pollo de 9 das de incubacin.
MEDIOS DE CULTIVO
Medio de cultivo Ventajas Desventajas
Animales vivos Estudio de la respuesta
del sistema inmunitario.
Pruebas de seguridad de
vacunas
Fuente de cultivos
celulares.
Aislar virus.
Produccin de vacunas

No todos los virus
causan enfermedad.
No todos los virus se
pueden cultivar.
Asintomticos
ETICA
Alto costo
Uso de varias especies
Personal altamente
capacitado para inocular
e identificar las
manifestaciones.
Picornavirus : virus de la fiebre aftosa
Rabdovirus: virus de la rabia
Cultivo celular
El procedimiento consiste bsicamente en
liberar las clulas del tejido original (tripsina),
formando una sola capa fina, denominada
Monocapa celular.
Llevarlas a un ambiente artificial que permita
su crecimiento, multiplicacin y mantenimiento
(medio con albmina, vitaminas, sales,
glucosa, un sistema buffer).




Pueden ser de 3 tipos:
a) Cultivo primario: Son clulas provenientes del
tejido original, no ms de 10 subcultivos. Las
clulas poseen el mismo cariotipo del tejido
original.
b) Lneas celulares diploides: Son clulas
derivadas de un cultivo primario, no ms de 50
subcultivos. El 75% (o ms) de la poblacin,
tiene el mismo cariotipo de las clulas
originales.
c) Lneas celulares continuas: Son clulas
derivadas de un cultivo primario, no menos de
70 subcultivos. Menos del 75 % de la poblacin
presenta el mismo cariotipo de las clulas
originales.
Luego de inoculado el cultivo celular, se
incuba a 35-37 C por un perodo de hasta 14
das, esperando la aparicin de efecto
citoptico. Se usan cultivos celulares no
inoculados para control y comparacin.
Cuando los virus no producen efecto
citoptico, se puede recurrir a tcnicas que
ponen en evidencia la presencia de aquel en
el cultivo. La ms usada es: hemadsorcin.

Medio de cultivo Ventajas Desventajas
Cultivos celulares
Clulas desarrolladas en
medios especiales
Aislamiento y
crecimiento de virus
exitoso.
Virus humanos
Infinidad de
generaciones

Despus de muchos
aos se pierden
caractersticas
originales.
Algunos virus no sean
podido cultivar.
Deben estar libre de
contaminacin
microbiana
Laboratorios y personal
especializado.

Cultivo en embrin de pollo
Proporciona una gran variedad de tipos
celulares que son susceptibles a muchos
virus, esto depende mucho del lugar donde
se lleve acabo la inoculacin.
Se emplean huevos de 5 a 14 das de
incubacin.
La reproduccin viral se comprueba por
lesiones locales sobre la membrana
corioalantoidea y su engrosamiento,
desarrollo de hemaglutininas, muerte del
embrin, a veces con aspecto hemorrgico.

Medio de cultivo Ventajas Desventajas
Embrin de pollo Aislamiento de virus
Fcil de mantener en
grandes cantidades
Bajo costo
Medio libre de
anticuerpos

Baja susceptibilidad a
virus humanos.
Cuidados de incubacin
( 39.5C, 60%
humedad, rotacin 2
veces al da)
ESTRUCTURA DEL EMBRIN DE POLLO de
514 DAS

Efecto citopatico (CPE)
EL efecto citoptico o citopatognico es un
conjunto de alteraciones visibles o no,
producidas por los virus, incluyen:
La suspensin de la sntesis de ARN.
La suspensin de la sntesis de protenas
estructurales.
La liberacin de enzimas txicas de los
lisosomas
Los cambios histolgicos (cuerpos de
inclusin).
CUERPOS DE INCLUSIN.
Los cuerpos de inclusin son acumlos
intracelulares de material nuevo. Algunos se
producen por acumulacin de viriones o de
subunidades virales no reunidas.

Estos cuerpos de inclusin pueden romper la
estructura celular o cambiar la funcin de tal modo
que produce la muerte celular.

Otros corpsculos pueden desarrollarse en sitios de
antiguas sntesis virales pero no contienen viriones
detectables, son ejemplos los corpsculos
eosinfilos intranucleares en clulas infectadas por
virus del herpes simple.
Formacin de cuerpos de inclusin. La
figura muestra la existencia de cuerpos de
inclusin intranucleares (teido en rosado
oscuro) en comparacin con el citoplasma
(teido en rosado) en cultivos de clulas
de la lnea MDCK inoculados con el
aislado RP5.
En el epitelio escamoso se observa
degeneracin celular con cambios
vacuolares y numerosos
queratinocitos necrticos. Algunas
clulas epidrmicas tienen cuerpos
de inclusin eosinfilos en el
citoplasma. En la dermis edematosa
se observan abundantes vasos
neoformados.
UTILIDAD DEL CULTIVO DE
VIRUS
Aislamiento.
Produccin de vacunas
Modelos de estudio
Identificacin y
clasificacin.
Verificacin de la
eficacia teraputica.

Vas de inoculacin

Se emplean huevos con 5 a 14 das de
incubacin, segn la va de inoculacin

*cavidad amnitica
*saco vitelino
*cavidad alantoidea
Membrana
corioalantoidea

ESTRUCTURA NORMAL
1. Transiluminar con el ovoscopio el
embrin de pollo, identificando y
marcando la cmara de aire y la
mancha ocular
2. Cortar el cascarn a la altura de la
cmara de aire, procurando que no
queden bordes filosos
3. Depositar el contenido del
embrin en una caja petri y
proceder a identificar las
estructuras
INOCULACIN EN MEMBRANA
CORIOALANTOIDEA .
1.- Transiluminar al
embrin e identificar
la cmara de aire
2.- Dividir imaginariamente al
embrin en tres partes, al final
del primer tercio sealar el
punto de inoculacin entre los
vasos sanguneos
3.- Perforar sobre la
cmara de aire y punto
de inoculacin
4.- Hacer la
inoculacin con una
aguja corta
5.- Succionar con una
boquilla por el orificio de la
cmara de aire para formar
una segunda cmara de
menos de n cm. De
dimetro.
6.- Con una aguja del 27 corta y
deposita 0,1ml del colorante.
INOCULACION EN SACO
VITELINO
Transiluminar al
embrin e identificar
la cmara de aire
En posicin horizontal identificar
el saco vitelino
Introducir una aguja larga verticalmente a travs de
la cmara de aire e inocular
Depositar 0,1 ml. De colorante
Inoculacin de la membrana
alantoidea
Transiluminar al embrin, identificar la
cmara de aire y marcar un punto en la
cima
Localizar una zona libre de vasos a 5mm por debajo
de la cmara de aire y del lado opuesto al embrin
marcar el punto de inoculacin
Perforar los puntos marcados
e inocular con aguja corta del
27 0,1 ml. De colorante.
Inoculacin en cavidad
amnitica.
Transiluminar al embrin, marcar la
cmara de aire y el punto de
inoculacin
Inocular con aguja larga
con la aguja 22, 0,1 ml de
colorante
Marcar el punto de
inoculacin
VA DE
INOCULACI
N
VIRUS
EFECTO
CITOGNICO
Cavidad
alantoidea
Influenza
Paperas
Enfermedad
de Newcastle
Hemaglutinaci
n
Muerte
embrionaria
Cavidad
amnitica
Influenza
Paperas
Muerte
embrionaria
Membrana
corioalantoide
a
Herpes simple
Sarcoma de
Rous
Viruela
Pstulas en la
membrana
Muerte
embrionaria
Saco vitelino Herpes simple
Muerte
embrionaria
Referencias
1. Stuart-Harris C, Shild G, Oxford J. Influenza:
the viruses and the disease. 2a London: Editorial
Arnold London,1985.
2. Kendal AP, Cate TR. Increases sensitivity and
reduced specificity of hemagglutination inhibition
tests with ether treated influenza b/
Singapore/222/79 J Clin Microbiol 1983; 18: 930-
934.
3. Harmon MW, Rota PA, Walls HH, Kendal AP.
Antibody responses in human to influenza type b
host cell derived variant following vaccination with
standard (eggs derivaded) vaccine or natural
infection. J Clin Microbiol 1988;26: 333-337.