INTEGRANTES: CARPIO DIANA GARCA CRISTIAN MORA JESSICA
FECHA: 14 OCTUBRE 2013 IMPORTANCIA BIOMDICA Las protenas son macromolculas fsica y funcionalmente complejas, que desempean diversas funciones de importancia vital. Posee una red interna de protenas, el citoesqueleto, mantiene la forma celular y la integridad fsica.
Los filamentos de actina y miosina forman la maquinaria contrctil del msculo. La hemoglobina transporta oxgeno, en tanto que los anticuerpos circulantes buscan invasores extraos. Las enzimas catalizan reacciones que generan energa, sintetizan y degradan biomolculas, duplican y transcriben genes, procesan mRNA, entre otras funciones. Los receptores permiten a las clulas detectar y responder a hormonas y otras seales del entorno. Una protena tpica nace en la traslacin, madura a travs de eventos de procesamiento postraslacionales como la protelisis parcial, alterna entre estados de trabajo y reposo con la intervencin de factores reguladores, envejece por oxidacin, desamidacin, entre otros y muere al degradarse a los aminocidos que la componen. Un objetivo importante de la medicina molecular es la identificacin de protenas cuya presencia, ausencia o deficiencia se relaciona con enfermedades o estados fisiolgicos especficos LAS PROTENAS Y PPTIDOS DEBEN PURIFICARSE ANTES DE SU ANLISIS Es esencial disponer de un estado muy puro de la protena para determinar con detalle sus propiedades fsicas y funcionales. Las clulas contienen miles de protenas distintas, cada una en cantidades variables por lo que se necesita el aislamiento de una protena especfica en cantidades suficientes para poder analizarla. MTODOS CLSICOS aprovechan las diferencias de solubilidad relativa de las protenas pH polaridad concentracin salina Las separaciones cromatogrficas dividen las molculas en dos fases, una mvil y otra estacionaria. Para la separacin de aminocidos o azcares, la fase estacionaria, o matriz, podra ser una hoja de papel de filtro (cromatografa en papel) o una capa de celulosa, slice o almina (cromatografa de capa fina, TLC).
CROMATOGRAFA EN COLUMNA Se emplea como fase estacionaria una columna que contiene pequeas cuentas esfricas de celulosa, acrilamida o slice modificadas cuya superficie se recubre, por lo comn, con grupos funcionales qumicos. Estas matrices de fase estacionaria interactan con protenas segn su carga, hidrofobicidad y propiedades de enlace de ligando. Se aplica una mezcla de protena a la columna y se hace pasar la fase mvil lquida. Porciones pequeas de la fase mvil, o eluyente, se colectan conforme salen.
CROMATOGRAFA DE PARTICIN Las separaciones cromatogrficas en columna dependen de la afinidad relativa de diferentes protenas para una fase estacionaria determinada y para la fase mvil. El vnculo entre cada protena y la matriz es dbil y transitorio. Las protenas que interactan con mayor fuerza con la fase estacionaria se retienen por ms tiempo. El tiempo que una protena se asocia con la fase estacionaria es funcin de la composicin tanto de la fase estacionaria como de la mvil. Por consiguiente, la separacin ptima de la protena de inters de las otras protenas se logra mediante la manipulacin cuidadosa de la composicin de las dos fases. CROMATOGRAFA DE EXCLUSIN POR TAMAO
La cromatografa de exclusin por tamao, o filtracin en gel, separa las protenas con base en sus radios de Stokes, el dimetro de la esfera que ocupan cuando entran en la solucin. Una protena alargada ocupa un volumen ms grande que una protena esfrica de la misma masa, en gel en orden descendente segn sus radios de Stokes. Para la cromatografa por absorcin, la mezcla de protenas se aplica a una columna en condiciones tales que la protena de inters se asocia con la fase estacionaria de manera tan firme que su coeficiente de particin es en esencia la unidad. Primero se eluyen y desechan las molculas que no se adhieren. Luego las protenas se liberan en forma sucesiva mediante la desorganizacin de las fuerzas que estabilizan el complejo protena-fase estacionaria, la mayor parte de las veces por medio de un gradiente de concentracin salina creciente. La composicin de la fase mvil se modifica poco a poco de modo que las molculas se liberan en forma selectiva y en orden descendente a su afinidad con la fase estacionaria.
CROMATOGRAFA POR ABSORCIN las protenas interactan con la fase estacionaria mediante interacciones carga-carga. Las protenas con una carga positiva neta a un pH determinado se adhieren a las cuentas con grupos funcionales cargados negativamente como carboxilatos o sulfatos (intercambiadores de cationes). De manera similar, las protenas con carga neta negativa se adhieren a las cuentas con grupos funcionales con carga positiva, por lo general aminas terciarias o cuaternarias (intercambiadores de aniones). Las protenas, que son polianiones, compiten contra los iones monovalentes por el enlace con el soporte, CROMATOGRAFA DE INTERCAMBIO INICO Ya que la carga neta de una protena se determina mediante el pH, la elucin sucesiva de protenas se podra lograr al cambiar el pH de la fase mvil. Otra opcin es que una protena se someta a ciclos consecutivos de cromatografa de intercambio inico, cada uno a pH distinto, de modo que las protenas que coeluyan a un pH eluyan a diferentes concentraciones salinas en otro pH.
CROMATOGRAFA DE INTERCAMBIO INICO R = depsito del lquido de fase mvil que trabaja o funciona por gravedad o mediante una bomba
C = columna de vidrio o plstico que contiene la fase estacionaria.
F = colector de la fraccin para reunir porciones, denominadas fracciones, del lquido eluyente en tubos de ensayo separados.
Las protenas se separan con base en su tendencia a unirse a una matriz de fase estacionaria recubierta con grupos hidrofbicos Las protenas con superficies hidrofbicas expuestas se adhieren a la matriz por medio de interacciones hidrofbicas que se incrementan mediante una fase mvil de fuerza inica alta. Las protenas no adherentes son las que se separan primero. La polaridad de la fase mvil disminuye al bajar poco a poco la concentracin salina. Si la interaccin entre la protena y la fase estacionaria es particularmente fuerte, se podra agregar etanol o glicerol a la fase mvil para disminuir su polaridad y debilitar an ms las interacciones hidrofbicas CROMATOGRAFA DE INTERCAMBIO HIDROFBICO Los pptidos se purifican mediante cromatografa de alta presin de fase reversa Las matrices de fase estacionaria de de columna clsica son generalmente esponjosos cuya compresibilidad limita el flujo de la fase mvil, en HPLC se emplean microcuentas de gel de slice o almina incomprensibles, estos materiales permiten el alto flujo y resolucin aumentada. HPLC de fase reversa Se hacen explotar una fase estacionaria hidrofbica de polmeros alifticos de 3 a 18 tomos de carbono de longitud.
Se efecta elucin de mezclas de peptido usando un gradiente de un solvente orgnico miscible en agua como acetonitrilo o etanol. Evaluacin de pureza mediante electroforesis. El mtodo ms utilizado es el SDS-PAGE electroforesis de gel de poliacrilmida, en presencia de un detergente anionico (SDS) duodecil sulfato de sodio.
en la electroforesis convencional se separan debido a sus cargas electricas, en la SDS- PAGE la poliacrilamida se polimeriza y se forma una red tridimensional o matriz porosa. Accin de la SDS Cuando la SDS se desnaturaliza tiene la posibilidad de unin a dos enlaces peptdicos, cuando se utiliza con 2- mercaptoetanol para reducir enlaces S-S o romperlos separa componente de protenas multimricas Enfoque isoelctrico Se utilizan buufers y un campo electrico aplicador para generar un gradiente de pH dentro de la matriz de poliacrilamida, las proteinas migran hasta encontrar su punto isolelectrico (el pH cuando la carga neta vale 0); el IEF se usa de manera frecuente para lograr una electroforesis bidimensional. La reaccin de Edman permite secuenciar polipptidos. El reactivo de Edman (fenilisotiocianato ) permite secuenciar para marcar el amino terminal de un polipptido. CON LA ESPECTROSCOPIA DE MASAS SE DETECTAN MODIFICACIONES COVALENTES ESPECTROMETRA DE MASAS (EM) VELOCIDAD SENSIBILIDAD VERSATILIDA D REEMPLAZO EDMAN DETERMINAR SECUENCIAS DE PPTIDOS Y PROTENAS POR LA ADICIN O SUPRESIN DE PARTES DE CARBOHIDRATOS, FOSFORILO, HIDROXILO U OTROS GRUPOS SUMAN O RESTAN INCREMENTOS ESPECFICOS DE MASA DISCRIMINA MOLCULAS BASADAS SOLO EN SU MASA DETECTAR LOS CAMBIOS FSICOS SUTILES EN LAS PROTENAS QUE OCURREN DURANTE EL CICLO DE VIDA DE UNA CLULA U ORGANISMO SE VAPORIZA AL VACO UNA MUESTRA LOS CATIONES LOS DESVA A TRAVS DE UN CAMPO MAGNTICO Y LOS DIRIGE A UN DETECTOR SE REGISTRA LA FUERZA MAGNTICA REQUERIDA PARA DESVIAR LA TRAYECTORIA DE CADA ESPECIE INICA SOBRE EL DETECTOR FUERZA MAGNTICA PROPORCIONAL A LA MASA INICA REJILLA ACELERADORA ELECTROIMN AJUSTABLE CAMPO MAGNTICO DETECTOR ESPECTROSCOPIA DE MASAS EN TNDEM SIN NECESIDAD DE PURIFICAR LAS MUESTRAS, ESPECTRMETROS CONECTADOS EN SERIE, SEPARA EL PPTIDO POR DIFERENCIA DE MASA LA GENMICA PERMITE IDENTIFICAR PROTENAS A PARTIR DE CANTIDADES PEQUEAS DE DATOS DE LAS SECUENCIAS CONOCIMIENTO DE LA SECUENCIA DEL GENOMA SE SIMPLIFICA LA TAREA PARA DETERMINAR UNA SECUENCIA DE AMINOCIDOS DE UNA PROTENA DERIVADA DEL DNA ORF (MARCO DE LECTURA ABIERTA) CODIFICA A LA PROTENA, ESTA SE PUEDA IDENTIFICAR EN ALGUNOS CASOS SOLAMENTE CON CONOCER UN SEGMENTO DE LA SECUENCIA DE AMINOCIDOS DE SOLO 4 O 5 RESIDUOS DE LONGITUD PARA IDENTIFICAR EL ORF CORRECTO PROTEMICA Y PROTEOMA PROTEMIC A IDENTIFICA EL COMPLEMENTO ENTERO DE PROTENAS ELABORADAS POR UNA CLULA EN DIVERSAS CONDICIONES PROTEOMA CONJUNTO DE TODAS LAS PROTENAS EXPRESADAS POR UNA CLULA EN UN INSTANTE PARTICULAR, REPRESENTA UN BLANCO MVIL DE DIMENSIONES EXTRAORDINARIAS LA ELECTROFORESIS BIDIMENSIONAL Y LOS CHIPS DE ARREGLO DE GENES SE UTILIZAN PARA ESTUDIAR LA EXPRESIN DE PROTENAS OBJETIVO DE PROTEMICA IDENTIFICAR PROTENAS CUYOS NIVELES DE EXPRESIN SE CORRELACIONA CON HECHOS DE IMPORTANCIA MDICA. SE SUPONE QUE LA APARICIN O DESAPARICIN DE PROTENAS SE RELACIONA CON UN ESTADO FISIOLGICO O ENFERMEDAD ESPECFICA, LAS CUALES PROPORCIONAN PISTAS ESENCIALES DE CAUSAS Y MECANISMOS. ELECTROFORESIS BIDIMENSIONAL SU VENTAJA ES QUE EXAMINA A LAS PROTENAS POR SI MISMAS. UN MTODO ALTERNATIVO Y COMPLEMENTARIO UTILIZA ARREGLOS DE GENES, DENOMINADOS CHIPS DE DNA, PARA DETECTAR LA EXPRESIN DE mRNA QUE CODIFICAN PROTENAS LA BIOINFORMTICA AYUDA A IDENTIFICAR LAS FUNCIONES DE LAS PROTENAS DESCUBRIR INFORMACIN DE POSIBLES PROPIEDADES, ACTIVIDADES FISIOLGICAS Y MECANISMOS DE ACCIN DE LAS PROTEINAS INFERIR AL COMPARAR SU ESTRUCTURA PRIMARIA CON LA DE PROTENAS CONOCIDAS RESUMEN LAS PROTENAS SON POLMEROS DE AMINOCIDOS O POLIPPTIDOS (UNIDAD BSICA ESTRUCTURAL), CUYA ESTRUCTURA PERMITE ENTENDER CMO CUMPLE SUS FUNCIONES LAS PROTENAS EXPERIMENTAN ALTERACIONES POSTRANSICIONALES QUE INFLUYEN EN SU FUNCIN Y DETERMINAN SU DESTINO EL MTODO DE EDMAN FUE REEMPLAZADO POR LA ESPECTROMETRA DE MASAS (HERRAMIENTA SENSIBLE PARA DETERMINAR LA ESTRUCTURA PRIMARIA, IDENTIFICAR MODIFICACIONES TRANSLACIONALES Y DETECTAR ANORMALIDADES METABLICAS LA CLONACIN DE DNA Y LA BIOLOGA MOLECULAR JUNTO CON LA QUMICA DE PROTENAS CONSTITUYEN MTODOS QUE INCREMENTAN LA VELOCIDAD Y EFICACIA PARA DETERMINAR ESTRUCTURAS PRIMARIAS DE PROTENAS LA GENMICA, EL ANLISIS DE TODA LA SECUENCIA DE OLIGONUCLETIDOS DEL MATERIAL GENTICO COMPLETO DE UN ORGANISMO, PRODUJO MEJORAS ADICIONALES.