IDENTIFICACIN DE LA INFECCIN POR

STREPTOCOCCUS INIAE EN DIFERENTES

RGANOS DE TILAPIA ROJA (OREOCHROMIS
SP) Y TILAPIA NILOTICA (OREOCHROMIS
NILOTICUS) POR PCR EN TIEMPO REAL

Frank Barreiro , Tec. Acui, Est MVZ; James Betancur, Zoot; Henry Ostos, M.D. MSc. Gentica

Grupo de Investigacin Laboratorio de Medicina Genmica, Universidad Surcolombiana, Neiva,
Colombia.
Grupo de Investigacin IMEVET, Universidad Corhuila, Neiva, Colombia.

barreirosanchez@Gmail.com


INTRODUCCIN
Las infecciones estreptocticas se han
diagnosticado en especies de cultivo y
peces salvajes.
El Streptococcus iniae ha sido identificado
por la Asociacin Americana de tilapia como
el ms importante grupo de patgenos que
afecta a la industria de cultivo de tilapia.
Importancia por el reporte de infecciones
zoonticas por Streptococcus iniae.


Streptococcus iniae
PCR EN TIEMPO REAL
Es una tcnica para la sntesis in vitro de
secuencias especficas de ADN. Las siglas PCR
significan Polimerase Chain Reaction:
reaccin en cadena de la polimerasa.
Desarrollada originalmente por Kary Mullis en la
dcada de los 80, por lo cual se le adjudic el
Premio Nobel de Qumica en 1993

La PCR En tiempo real es una tcnica con alta
sensibilidad, especificidad y semiautomatizada,
que evita el manejo post PCR. Emplea sondas
(taqman) de secuencias marcadas con
fluorocromos.

OBJETIVOS
Objetivo general:
Identificar la distribucin de la infeccin por
Streptococcus iniae en diferentes rganos de
tilapia roja (Oreochromis sp) y tilapia nilotica
(Oreochromis niloticus) diagnosticada por
PCR en tiempo real.


Objetivos especifico
Determinar e identificar la distribucin de la
infeccin en Cerebro, Hgado y Corazn.

Describir hallazgos histopatolgicos en
cerebro, hgado y corazn de individuos
infectados con Streptococcus iniae.

METODOLOGA

PROTOCOLO DE PCR EN TIEMPO REAL
Control Positivo
Se realiz la extraccin de DNA de los cultivos puros de la
cepa de Streptococcus iniae, (fue adquirida de ATTC No.
29178)

Diseo de primers
El grupo Laboratorio de Medicina Genmica, diseo los
primers, a partir de las secuencias de la accesin No.
Y07622.1 protena Lactato oxigenasa (lctO) (S. iniae). En
esta regin se disearon los primers especficos de la
especie, utilizando el Software Primer Express 3.0 Applied
Byosistems, el equipo utilizado fue Applied Biosystems
7300 Real-Time PCR System+
Primers utilizados para el diagnstico de
Streptococcus iniae por PCR en tiempo real


Forward GTT TTC TTG AAG CTA TTG CAG GTT T
Reversed CGC GCA AGG GTT TCA TG
Sonda VIC-CTGCGGTTGCCATACCAGCAAGTATTCTA- TAMRA
Reactivo Cantidad
Taqman Universal PCR master mix (2X)
12.5 ul
Taq man (sonda) 0.5 ul
Primer F (10 uM) 1.25 ul
Primer R (10 um) 1.25 ul
DNA 1 ul
Agua 8.5 ul
TOTAL
25 ul
Protocolo de perfiles de temperatura para PCR en tiempo real.
50 C por 2 minutos
95 C por 10 minutos
40 ciclos
95C por 15 segundos
60 C por 1 minutos
ANLISIS ESTADSTICO
Los resultados se analizaron con estadstica
descriptiva y anlisis de frecuencias con el
paquete estadstico INFOSTAT
RESULTADOS
Extraccin de DNA a
partir de muestras
congeladas a -20C.
La cantidad de DNA
obtenido con el kit
comercial de Quigen
segn el protocolo para
bacterias de la misma
marca comercial se
encuentra en la tabla
siguiente, la medicin se
realiz con el equipo
NanoDrop 2000

RGANOS POSITIVOS PARA LA INFECCIN
STREPTOCOCCUS INIAE.
Individuo rganos infectado
130 Corazn - Hgado
332 Cerebro
333 Corazn
414 Corazn
416 Corazn
59 Hgado
627 Corazn - Cerebro
628 Hgado Cerebro
629 Hgado
77 Hgado Cerebro

CURVAS DE INDIVIDUOS POSITIVOS
SENSIBILIDAD DE LA PCR TIEMPO REAL

ESPECIFICIDAD DE LA PRUEBA PCR TIEMPO
REAL
CONCLUSIONES
Primer reporte para Colombia para esta enfermedad.
Por la magnitud del problema de Streptococcus iniae a
nivel mundial, se decidi mirar la distribucin de la
infeccin por rgano.
La importancia de seguir con monitoreos continuos, por
la implicaciones que tiene S. iniae en la salud de los
peces y como agente zoontico.
S. iniae es una infeccin muy grave y puede tener
grandes problemas sobre la actividad acucola del Huila y
sobre los recursos icticos nativos.
El diagnostico por PCR en tiempo real es una
herramienta de alta sensibilidad, especificidad y rapidos
resultados para este patgeno.