ACIDOS

NUCLEICOS
MSc. CSAR ALBERTO GUZMN VIGO
cguzmanvigo@gmail.com
SON POLMEROS CONSTITUDOS
POR LA UNIN MEDIANTE
ENLACES QUMICOS DE
UNIDADES MENORES LLAMADAS
NUCLETIDOS

SON COMPUESTOS DE ELEVADO
PESO MOLECULAR , ES DECIR
MACROMOLCULAS
ACIDOS NUCLEICOS
Friedrich Miescher, trabajando en el laboratorio de Flix Hoppe-Seyler, en el Castillo
de Tbingen (Alemania), descubri en 1869 el DNA, al que llam nuclena
Me parece que va a
emerger una completa
familia de estas nuclenas
que contienen fsforo que
quiz merezca igual
consideracin que las
protenas
Acido Nuclico: polmero de nucletidos
Componentes de un nucletido:
base N + pentosa + fosfato
RNA
DNA
Azcares de los cidos nuclicos
(RNA) (DNA)
Bases nitrogenadas de los cidos nuclicos
ENLACE b
GLUCOSDICO
Nucletidos del DNA
Rosalind Franklin
Maurice Wilkins
Modelo de Watson y Crick (1953) de la estructura del DNA
Replicacin del DNA segn Watson y Crick
El RNA: ribonucletidos
Procesamiento del rRNA (nucleolo)
Los genes eucariticos alternan secuencias
codificantes (exones) y no codificantes (intrones)
Procesamiento del htRNA eucaritico
NUCLEO
CITOPLASMA
Traduccin
Exportacin
Asociacion de un gen una funcin
Mendel: Un gen una caracterstica
Boveri, Weismann, Sutton: Los genes forman
parte de los cromosomas
Morgan, Sturtevant : Los genes tienen
localizacin especfica
Griffith, Avery, Hersey y Chase: Genes
compuestos de ADN
Watson y Crick: Estructura de DNA:
Codificacin heredable

Se define el mecanismo por medio del cual la
informacin almacenada en un gen se
convierte en el trabajo que gobierna las
actividades celulares?
Relacin entre genes y protena
Archibald Garrod (1908): enfermedades,
efecto de ausencia de enzimas especficas:
Alcaptonuria (Ausencia de enzima que oxida
el cido homogentsico)
Manchas
oscuras en la
Esclertica
(Ocronosis)
Beadle y Tatum (1940): Resucitaron la idea de que los genes controlaban la produccin
de protenas. Experimento de mutantes genticos en Neurospora.
Hiptesis un gen = una enzima,
Un gen un = polipptido
FLUJO DE LA INFORMACIN EN UNA CLULA
EUCARIOTA
TRANSCRIPCIN: Sntesis de un RNA a partir
de un DNA
TRADUCCIN: Sntesis de protenas, requiere
de ribosomas (protenas + RNA). Los RNA de
un ribosoma se conocen como RNA
ribosomales, cada uno se transcribe a partir
de las cadenas de un gen.
Los RNA ribosomales: reconocen y unen otras
molculas, proveen apoyo estructural y
catalizan las reacciones qumicas por medio de
las cuales los aminocidos se unen de manera
covalente
La traduccin tambin requiere RNAt
SINOPSIS DE LA TRANSCRIPCIN
Enzimas: RNA polimerasa. El sitio de
unin en el DNA, se llama promotor,
Requieren la ayuda de factores
Transcripcionales.
La polimerasa se mueve hacia el extremo
Terminal 5. Conforme la polimerasa avanza
El DNA crece del extremo 5 en una
Direccin 3 .
Las polimerasas son capaces de incorporar
De 20 a 50 nu. por segundo
35pb. 15pb. 9pb.
Sntesis de RNA
1. vinculacin de la polimerasa con el DNA
molde: Promotor (determina cul de las dos
cadenas del DNA se transcribe, y sitio). El
promotor para el reconocimiento necesita de
factores transcripcionales
2. Movimiento de la polimerasa hacia el
extremo 5 terminal y ensamblaje de una
cadena complementaria de RNA, por
incorporacin de nucletidos
3. la polimerasa incorpora alrededor de 20 a
50 nucletidos por segundo

Las clulas eucariotas tienen tres enzimas que transcriben:
La RNA polimerasa I: Sintetiza RNA ribosomal grande (28S, 18S,
5.8S)
La RNA polimerasa II: Sintetiza RNAm y la mayora de RNA
nucleres pequeos (snRNA y snoRNA)
La RNA polimerasa III: Sintetiza RNAt, RNAr 5S y el snRNA U6
La transcripcin requiere de una variedad de protenas accesorias
o factores de transcripcin, contribuyen a la unin de la
polimerasa al DNA molde
Los tres tipos de RNA derivan de molculas precursoras de RNA,
que son mucho ms grandes que el producto final de RNA, que es
equivalente en longitud a un transcrito primario o pre-RNA
El segmento correspondiente del DNA del cual procede un
transcrito primario se conoce con el nombre de unidad de
transcripcin
Transcripcin y procesamiento del RNA en
clulas eucariotas
Entre 73 y 92 nucletidos
Aparte de A,U,G,C, tiene bases raras:
Seudouridina(), Ribotimidina (T), mI
(metilinosina), Inosina (I), dimetilguanosina
(me2G),Dihidrouridina (D), metilguanosina
(meG.
Poseen secuencias de nucletidos en un
segmento de la molcula que son
complementarias de secuencias localizadas
en otras partes de la molcula.
A causa de secuencias complemntarias
todos los RNA tienen la posibilidad de
plegarse para formar estructura que semeja
una hoja de trebol
El aminocido siempre se fija en la adenina
en el extremo 3
Las bases raras se encuentran en las asas,
interrumpen formacin de puentes de
hidrgeno y sirven de sitio de reconocimiento
para diferentes protenas
La parte del RNAt que participa en la
interaccin con el RNAm se denomina
anticodn, localizado en el asa media de la
molcula. Dicha asa se compone
invariablemente de siete nucletidos y los
tres mediales forman el anticodn.
Los aa. se unen al RNAt por accipn de la
sintetasa de aminoacil RNAt
Los RNAt actan como adaptadores, llevan a cabo la
decodificacin de la informacin de un mRNA.
Por un lado se une a un aa. Especfico y por otro lado a un
mRNA.


SINTESIS DE PROTENAS
1. Ocurre de modo semejante en todas
las clulas
2. Tres tipos de RNA desempean papel
cooperativo
RNAm Transportador de la
informacin
RNA Asociado a protenas forma el
ribosoma
RNAt portadores de aminocidos
lectores del mensaje
3. El orden de los aminocidos en la
cadena proteica (secuencia) esta
determinada por
4. El orden de los aminocidos en la
cadena proteica (secuencia)
determina la funcin de la nueva
protena
5. Es necesario un cdigo bilinge para
pasar la informacin de la secuencia
de bases a aminocidos



Mtodos de
identificacin
La electroforesis en Geles es una tcnica ampliamente
utilizada para el anlisis de protenas y cidos nucleicos.
La electroforesis en gel de Agarosa es rutinariamente
utilizada para el anlisis del AND
La agarosa es extrada de las algas, polisacrido lineal
(con peso molecular ~12 000 Da), es una repeticin de la
unidad bsica, la agarobiosa, que comprende unidades
alternadas de galactosa y 3,6- anhidrogalactosa.
La electroforesis en gel es un procedimiento que
separa las molculas sobre la base de su
velocidad de movimiento bajo la influencia de un
campo elctrico.

ELECTROFORESIS EN GELES
DNA es una molcula cargada negativemente.
+ -
Fuente de
poder
DNA
Cuando es colocado el DNA en un campo elctrico, migra hacia el polo
positivo.
H
^
O
2
^
Un gel de agarosa es utilizado para determinar el movimiento del DNA y
separado por tamaos.
Scanning Electron Micrograph of
Agarose Gel (11 m)

La agarosa polimerizada es porosa,
permitiendo el movimiento del ADN
+ -
DNA
Qu rpido puede migrar el ADN?
Intensidad del campo elctrico, buffer, densidad del gel de agarosa
Size of the DNA!
*DNA pequeo se mueve ms rpido que el DNA gran tamao
La electroforesis en gel separa el ADN de acuerdo a su tamao
small
large
Dentro del gel de agarosa, el AND migra inversamente
proporcional al log
10
de su peso molecular.
Fuente de
poder
Fuente de poder
Buffer de corrida:
Buffer de carga:
ELECTROFORESIS EN GELES
Bandeja7
Peines para el gel7
Fuente de poder
Tanque para el gel
Tapa
Cables elctricos
+
Equipo de Electroforesis
Colocacin del gen el la cmara de electroforesis
buffer
El buffer de electroforesis cubre el gel hasta una profundidad
de lo menos 1 mm.
NCtodo
(negativo)
nodo7
(positivo)
^
Lugar de inicio
^ ^ ^
DNA
Cuidadosamente se coloca la puntera de la pipeta sobre pozo
(hueco) y poco a poco expulsar la muestra. La muestra deber
hundirse dentro del pozo. Tener cuidado de no perforar el gel con
la puntera.
100
200
300
1,650
1,000
500
850
650
400
12,000 bp
5,000
2,000
DNA Ladder Standard
-
+
Migracin
del ADN

Azul de bromofenol
Nota: El azul de bromofenol
migra aproximadamente a la
misma velocidad que una
molcula de ADN de 300 pb.
Tcnicas BLOTTING
Blotting technique

Southern Blot

It is used to detect DNA.

Northern Blot

It is used to detect RNA.
Western blot

It is used to detect protein.
Professor Sir Edwin Southern
Southern Blotting
Capillary plotting apparatus
Southern Blotting: Pasos
1. Digestin del ADN con una
apropiada enzima de
restriccin

2. La mezcla compleja de
fragmentos es colocado el
gel de electroforesis para
la separacin de
fragmentos de acuerdo a
su tamao.

Southern Blotting: Pasos
3. Los fragmentos de restriccin
presentes en el gel son
denaturados con alcal y
tansferidos a
4. a una membrana de
nitrocelulosa (filtro) o
membrana de nylon para
blotting.

Este procedimiento preserva la distribucin de los fragmentos
en el gel, creando una replica del gel sobre el filtro.
Southern Blotting: pasos
5. El filtro es incubado bajo condiciones de hibridizacin
con una sonda especfica radioisotpica (radiolabeled
DNA probe).
La sonda hibridiza al fragmento de restriccin
complementario.
6. El exceso de la sonda es lavado y la sonda que
permanece unida al filtro es detectada por
autoradiografa, lo cual revela el fragmento de ADN que
se mantiene unido a la sonda hibridizada.


Southern Blotting: Pasos
Southern Blotting
Southern Blotting
Reaccin en cadena de la polimerasa(PCR)
Procedimiento


Desnaturalizacin: Calor de 94C. Hay una
separacin fsica de las dos cadenas.
Hibridizacin: La temperatura se reduce a 54C.
Extensin: Temperatura de polimerasas 72C., los
primers tienen una fuerte atraccin al molde o
templado

Reaccin en cadena de la polimerasa(PCR)
Procedimiento
Si repetimos el ciclo, tendremos cuatro copias

Fusin
95C
Hibridizacin
50-60C
Extensin de
La cadena
75C
Primer Ciclo
2
do
Ciclo
95C
50 - 60C
75C
Mltiples ciclos darn un incremento exponencial en el nmero de copias
Reaccin en cadena de la polimerasa(PCR)
Procedimiento


Reaccin en cadena de la polimerasa(PCR)
Procedimiento
Reaccin en cadena de la polimerasa(PCR):
Componentes esenciales en el proceso
ADN polimerasa termoestable (Taq ADN polimerasa:
Taq Thermus aquaticus, Pwo Pyrococcus woesei, Pfu Pyrococcus furiosus, Tli Thermococcus
littoralis)
Oligonucleotidos iniciadores (primers)
Desoxiribonucletidos trifosfatados
(dNTPs)
Cationes divalentes
Buffer (para mantener el pH)
ADN molde (Templado)