ENZIMAS DE

RESTRICCIN
Duverney Gaviria Arias
Enzimas de restriccin
Una enzima de restriccin (o endonucleasa de restriccin) es
una enzima que corta el ADN en o cerca de las secuencias de
nucletidos especficas de reconocimiento conocidas como
sitios de restriccin.
Las enzimas de restriccin se clasifican comnmente en tres
tipos, que difieren en su estructura y si se cortan el sustrato
de ADN en su sitio de reconocimiento, o si el reconocimiento
y los sitios de escisin estn separados el uno del otro.
Para cortar el ADN, todas las enzimas de restriccin hacen
dos incisiones, una vez a travs de cada esqueleto de
azcar-fosfato (es decir, cada captulo) de la doble hlice del
ADN.
Enzimas de restriccin
Estas enzimas se encuentran en las bacterias y arqueas y
proporcionan un mecanismo de defensa contra los virus
invasores
Dentro de un procariota, las enzimas de restriccin cortan
selectivamente ADN extrao en un proceso llamado
restriccin;. Mientras que el ADN de acogida est protegido
por una enzima de modificacin (una metilasa) que modifica
el ADN procaritico y bloques de escisin.
Juntos, estos dos procesos forman el sistema de modificacin de la
restriccin.
Ms de 3.000 enzimas de restriccin han sido estudiados en
detalle, y ms de 600 de estos estn disponibles
comercialmente.
Clonacin molecular
Referencia: Specific Cleavage of Simian
Virus 40 DNA by Restriction Endonuclease
Sitios de reconocimiento
Las secuencias de reconocimiento por lo general varan entre
4 y 8 nucletidos, y muchos de ellos son palindrmicas, es
decir, la secuencia de bases se lee en la misma hacia atrs y
hacia adelante.
En teora, hay dos tipos de secuencias palindrmicas que
pueden ser posible en el ADN.
Palindrome como espejo
GTAATG
Palindrome de repeticiones invertidas
GTATAC
Neoschizomer
Isoschizomers
Isocaudomer
son pares de enzimas de restriccin que tienen ligeramente
diferentes secuencias de reconocimiento, pero tras la
escisin generan extremos idnticos.
Mbo I y BamH I
Tipos
Endonucleasas de restriccin presentes en la naturaleza se
dividen en cuatro grupos (Tipos I, II, III, y IV)
Composicin
Requisitos de cofactor de la enzima
Naturaleza de su secuencia diana
Posicin de su sitio de escisin de ADN en relacin con la secuencia
diana.
Todos los tipos de enzimas que reconocen secuencias
cortas de ADN especficas y llevar a cabo la escisin
endonucleoltica de ADN para dar fragmentos especficos
con el terminal 5'-fosfatos.
Referencias:
Biology of DNA Restriction
Tipos
Enzimas tipo I corta en sitios remotos desde el sitio de
reconocimiento; requerir tanto ATP y S-adenosil-L-metionina a la
funcin; protena multifuncional con actividades tanto de restriccin
y metilasa (CE 2.1.1.72)
Enzimas tipo II (EC 3.1.21.4) escinden dentro o en las distancias
cortas especficas de sitio de reconocimiento, la mayora requiere
de magnesio; funcin nica (restriccin) enzimas independientes
de metilasa
Enzimas tipo III (EC 3.1.21.5) escindir en sitios a poca distancia
del sitio de reconocimiento; requieren ATP (pero no se hidroliza), S-
adenosil-L-metionina estimula la reaccin, pero no es necesario,
existen como parte de un complejo con una metilasa modificacin
(CE 2.1.1.72).
Enzimas Tipo IV se dirigen a ADN modificado, por ejemplo, ADN
metilado, hidroximetilada y glucosil-hidroximetilada
Tipo I
Las primeras en ser identificados y se identificaron por primera vez
en dos cepas diferentes de E. coli (K-12 y B).
Estas enzimas cortan en un sitio que es diferente, y es una
distancia aleatoria (al menos 1000 pb) de distancia, desde su sitio
de reconocimiento.
La escisin en estos sitios al azar sigue un proceso de translocacin de
ADN, lo que demuestra que estas enzimas tambin son motores
moleculares.
El sitio de reconocimiento es asimtrica y se compone de dos
porciones especficas-uno que contiene 3-4 nucletidos, y otro que
contiene 4-5 nucletidos-separados por un espaciador no
especfica de alrededor de 6-8 nucletidos.
Enzimas multifuncionales
Restriccin
Modificacin.

Tipo I
Los cofactores
S-adenosil metionina (AdoMet)
trifosfato de adenosina hidrolizada (ATP)
magnesio (Mg 2 +) iones.
El tipo I enzimas de restriccin poseen tres subunidades
HsdR se requiere para la restriccin
MSDS es necesario para la adicin de grupos metilo para albergar el
ADN (actividad metiltransferasa)
HsdS es importante para la especificidad del sitio de reconocimiento
(de unin a ADN) adems de tanto la restriccin (divisin del ADN) y la
modificacin (ADN metiltransferasa) la actividad.
Tipo II
Enzimas de restriccin de tipo II tpicos difieren de las
enzimas de restriccin tipo I de varias maneras.
Son un homodmero, con sitios de reconocimiento son por lo
general no divididos y palindrmicos entre 4-8 nucletidos de
longitud.
Se reconocen y escinden el ADN en el mismo sitio, y que no utilizan
ATP o AdoMet
Si Mg+2
Clasificacin compleja
Tipo II
Tipo IIB (BCGI y BplI) son multmeros, que contiene ms de una subunidad. Cortan a
ambos lados de su reconocimiento para recortar el sitio de reconocimiento.
AdoMet y cofactores Mg2+.
Tipo IIE (NaeI IIE) cortan el ADN despus de la interaccin con dos copias de su
secuencia de reconocimiento.
Un sitio de reconocimiento acta como el objetivo para la escisin, mientras que el otro
acta como un efector alostrico que acelera o mejora la eficiencia de la enzima.
Tipo IIF (NgoMIV) interactuar con dos copias de la secuencia de reconocimiento, pero
escinden ambas secuencias al mismo tiempo.
Tipo IIG (Eco57I) tienen una nica subunidad, como el tipo clsico enzimas de
restriccin II, pero requiere el cofactor AdoMet.
Tipo IIM (DpnI), son capaces de reconocer y cortar el ADN metilado.
Tipo IIS (FokI) escinden el ADN en un definido distancia de sus lugares de
reconocimiento asimtrico no palindrmicas.
Estas enzimas pueden funcionar como dmeros.
Tipo IIT (Bpu10I y BslI) se componen de dos subunidades diferentes. Algunos
reconocen secuencias palindrmicas, mientras que otros tienen sitios de
reconocimiento asimtricos.
Tipo III
Enzimas de restriccin de tipo III (EcoP15) reconocen dos
secuencias no palindrmicas independientes que estn orientadas
inversamente.
Cortan ADN alrededor de 20-30 pares de bases despus del sitio de
reconocimiento.
Estas enzimas contienen ms de una subunidad y requieren
AdoMet y cofactores de ATP
Las enzimas de tipo III son protenas hetero-oligmeros
multifuncionales compuestos por dos subunidades, Res y MOD.
Mod. reconoce la secuencia de ADN especfica para el sistema y es una
modificacin metiltransferasa
Funcionalmente equivalente a las subunidades de las enzimas de restriccion tipo
I.
Res se requiere para la restriccin, a pesar de que no tiene actividad
enzimtica por s solo.
Tipo III
Las enzimas de tipo III reconocen secuencias asimetricas de
5-6 bp y escinden 25-27 pb aguas abajo dejan 5 'salientes
Requieren la presencia de dos sitios de reconocimiento no
metilados orientadas inversamente para que se produzca la
restriccin.
Estas enzimas metilan slo una hebra del ADN, en la posicin
N-6 de los residuos de adenosina, por lo que el ADN recin
replicado tendr slo una hebra metilado, que es suficiente
para proteger contra la restriccin.
Enzimas de tipo III pertenecen a la subfamilia de beta-N6
metiltransferasas adenina, que contiene los nueve motivos que
caracterizan a esta familia, incluyendo motivo I, el bolsillo de unin de
AdoMet (FXGXG), y el motivo IV, la regin cataltica (S / D / N (PP ) S /
F).
Tipo IV y V
Tipo IV
Enzimas de Tipo IV reconocen ADN modificado, tpicamente metilado y
se ejemplifican por los sistemas McrBC (Methylation Dependent
Restriction Enzyme) y Mrr de E. coli.
Tipo V
Enzimas de restriccin de tipo V (por ejemplo, el complejo cas9-gRNA
de CRISPRs: Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic
Repeats) utilizan guas de RNAs para apuntar secuencias no
palindrmicas especficos que se encuentran en los organismos
invasores.
Pueden cortar el ADN de longitud variable, siempre que est prevista
una gua adecuada de RNA.
La flexibilidad y la facilidad de uso de estas enzimas hacen prometedor para
futuras aplicaciones de ingeniera gentica.
Enzimas de restriccin artificiales
Enzimas de restriccin artificiales pueden ser generados por
la fusin de un dominio de unin a ADN natural o construida
a un dominio de nucleasa
Dominio de escisin de la enzima de restriccin de tipo IIS FokI.
Tales enzimas de restriccin artificiales pueden dirigirse a
sitios de ADN de gran tamao (hasta 36 pb) y pueden ser
diseados para unirse a secuencias de ADN deseadas.
FokI
Enzimas de restriccin artificiales
Nucleasas de dedos de zinc son las enzimas de restriccin
artificiales ms comnmente utilizados y generalmente se
usan en aplicaciones de ingeniera gentica
Otras enzimas de restriccin artificiales se basan en el dominio de unin
a ADN de efectores TAL.
Helix-turn-helix
Zinc finger
Leucine zipper
Winged helix
Winged helix turn helix
Helix-loop-helix
HMG-box
Wor3 domain

Lac
repressor
zinc finger
Referencia:
Genome Engineering With Zinc-
Finger Nucleases.
Nomenclatura
Desde su descubrimiento en la dcada de 1970, ms de 100
enzimas de restriccin diferentes se han identificado en
diferentes bacterias.
Cada enzima se nombra despus de la bacteria de la que se
aisl utilizando un sistema de nomenclatura basado en
gnero de bacterias, las especies y la cepa.
Abbreviation Meaning Description
E Escherichia genus
co coli species
R RY13 strain
Derivation of the EcoRI name
I
First
identified
order of
identification
Actividad Star
Relajacin o la alteracin de la especificidad de la enzima de
restriccin mediada por la escisin de ADN que puede ocurrir
bajo condiciones de reaccin que difieren significativamente
de los ptimo para la enzima.
El resultado es tpicamente la escisin en el sitio de reconocimiento no
cannica, o algunas veces la prdida completa de especificidad
Las diferencias que pueden conducir a esta actividad
incluyen baja fuerza inica, pH alto, y alta de
concentraciones de glicerol (> 5% v / v).
La ltima condicin es de especial inters prctico, puesto que las
enzimas de restriccin comerciales se suministran normalmente en un
tampn que contiene una cantidad sustancial de glicerol (50% v / v es
tpico).
Insuficiente dilucin de la solucin de enzima puede causar esta actividad;
este problema surge durante digestin doble o mltiple.
Aplicaciones
Se utilizan para ayudar a la insercin de genes en vectores de
plsmido durante la clonacin de genes y los experimentos de
expresin de protenas .
Sitio de clonacin mltiple o MCS) rico en secuencias de reconocimiento de
enzimas de restriccin .
Para clonar un fragmento del gen en un vector , tanto ADN plsmido
y el inserto gen se cortan tpicamente con las mismas enzimas de
restriccin , y luego pegadas entre s con la ayuda de una enzima
conocida como una ADN ligasa.
Referencia:
http://www.embl.de/pepcore/pepcore_services/cloning/cloning_methods/rest
riction_enzymes/


Aplicaciones
Las enzimas de restriccin tambin pueden ser utilizados para
distinguir alelos de genes al reconocer especficamente los
cambios de una sola base en el ADN conocidas como
polimorfismos de nucletido nico (SNP ).
La muestra se digiri primero con la enzima de restriccin para generar
fragmentos de ADN , y luego los diferentes fragmentos de tamao
separadas por electroforesis en gel.
En general, los alelos con sitios de restriccin adecuados generarn dos
bandas visibles de ADN en el gel , y los que tienen sitios de restriccin
alterados no puedan quedar aislados y generarn una sola banda.
De una manera similar , las enzimas de restriccin se usarn para
digerir el ADN genmico para el anlisis del gen por transferencia
de Southern . Esta tcnica permite a los investigadores a
identificar el nmero de copias (o parlogos ) de un gen estn
presentes en el genoma de un individuo , o el nmero de
mutaciones de genes ( polimorfismos ) se han producido dentro de
una poblacin.
El ltimo ejemplo se denomina polimorfismo de longitud de
fragmentos de restriccin ( RFLP ).