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O documento discute mecanismos e ferramentas para avaliação de toxicidade de novos candidatos a fármacos (NCEs). Aborda os principais mecanismos de toxicidade como alvo terapêutico, não-alvo e metabólitos reativos, e descreve ferramentas experimentais como ensaios em células HepG2 e cardiotoxicidade. Também discute a importância de combinar ensaios in vitro e in vivo para avaliação pré-clínica completa da toxicidade de NCEs.
O documento discute mecanismos e ferramentas para avaliação de toxicidade de novos candidatos a fármacos (NCEs). Aborda os principais mecanismos de toxicidade como alvo terapêutico, não-alvo e metabólitos reativos, e descreve ferramentas experimentais como ensaios em células HepG2 e cardiotoxicidade. Também discute a importância de combinar ensaios in vitro e in vivo para avaliação pré-clínica completa da toxicidade de NCEs.
O documento discute mecanismos e ferramentas para avaliação de toxicidade de novos candidatos a fármacos (NCEs). Aborda os principais mecanismos de toxicidade como alvo terapêutico, não-alvo e metabólitos reativos, e descreve ferramentas experimentais como ensaios em células HepG2 e cardiotoxicidade. Também discute a importância de combinar ensaios in vitro e in vivo para avaliação pré-clínica completa da toxicidade de NCEs.
Recentemente, estudos eram realizados somente durante os ensaios clnicos. Descarte de 20 30%. Ensaios mais prematuros causariam: de custos; no tempo; da eficcia na obteno de novos candidatos. KERNS; DI, 2008, Introduo KERNS; DI, 2008, Introduo KERNS; DI, 2008,
Maximizar a Janela Teraputica Introduo KERNS; DI, 2008, Introduo
A toxicidade pode ser desencadeada por diferentes mecanismos: KERNS; DI, 2008,
A toxicidade pode ser desencadeada por diferentes mecanismos: Alvo teraputico
A toxicidade pode ser desencadeada por diferentes mecanismos: Alvo teraputico; No-alvo teraputico; Metablito reativo
A toxicidade pode ser desencadeada por diferentes mecanismos: Alvo teraputico; No-alvo teraputico Introduo: Termos e Mecanismos Toxicidade aguda KERNS; DI, 2008, Toxicidade crnica Carcinogenicidade Citotoxicidade Genotoxicidade Reao idiossincrtica Imunotoxicidade Toxicidade em orgos Fosfolipidose Toxicologia reprodutiva Segurana farmacolgica Teratogenicidade Toxicidade aguda Toxicidade crnica Carcinogenicidade Citotoxicidade Genotoxicidade Reao idiossincrtica Imunotoxicidade Toxicidade em orgos Fosfolipidose Toxicologia reprodutiva Segurana farmacolgica Teratogenicidade Mecanismo: Alvos Teraputicos Modulaes nos alvos teraputicos podem trazer efeitos indesejveis ao tecido alvo ou ao organismo como um todo. KERNS; DI, 2008, Observada em estudos in vivo ou ensaios clnicos. Mecanismo: No-Alvos Teraputicos KERNS; DI, 2008, Avaliao in vitro de ligao ou atividade em diversos alvos moleculares, ou estudo in vivo com monitoramento de diversas funes fisiolgicas. O composto pode inibir inesperadamente uma enzima ou receptor, causando toxicidade ou efeitos adversos. Mecanismo: Metablito Reativo KERNS; DI, 2008, Modificao estrutural em protenas pode induzir resposta imune Hepatotoxicidade O metablito, ou intermedirio, pode ser um eletrlito, ligando covalentemente a nuclefilos endgenos como o DNA. KERNS; DI, 2008, Mecanismo KERNS; DI, 2008, Mecanismo KERNS; DI, 2008, Ferramentas Experimentais KERNS; DI, 2008, O metablito, ou intermedirio, pode ser um eletrlito, ligando covalentemente a nuclefilos endgenos como o DNA. O metablito, ou intermedirio, pode ser um eletrlito, ligando covalentemente a nuclefilos endgenos como o DNA: Genotoxicidade O metablito, ou intermedirio, pode ser um eletrlito, ligando covalentemente a nuclefilos endgenos como o DNA: Genotoxicidade; Toxicidade em rgo especficos O metablito, ou intermedirio, pode ser um eletrlito, ligando covalentemente a nuclefilos endgenos como o DNA: Genotoxicidade; Toxicidade em rgo especficos: Cardiotoxicidade; Hepatotoxicidade; Hematotoxicidade; Fototoxicidade; Neurotoxicidade; Nefrotoxicidade. O metablito, ou intermedirio, pode ser um eletrlito, ligando covalentemente a nuclefilos endgenos como o DNA: Genotoxicidade; Toxicidade em rgo especficos: Cardiotoxicidade; Hepatotoxicidade; Hematotoxicidade Ferramentas Experimentais KERNS; DI, 2008, Crescente necessidade antecipar os ensaios toxicolgicos.
Aprimorar as ferramentas existentes para melhores rendimentos e qualidade de anlise. Ensaios de ADME so muito mais sofisticados que os de toxicidade. Cardiotoxicidade WANG; URBAN; BOJANIC, 2007 Vrios frmacos retirados do mercado afetavam uma nica protena no-alvo. Canal inico de K + , especfico do corao (subunidade ) Parcialmente responsvel pela repolarizao do potencial de ao. Hepatotoxicidade WANG; URBAN; BOJANIC, 2007; XU; HOFFMASTER, 2011 HepG2 (clula de hepatocarcinoma) Estudos gerais de potencial de citotoxicidade. As clulas podem ser induzidas expresso de CYP Avaliao de necrose celular atravs dos nveis intracelulares de ATP. Somente clulas saudveis so capazes de produzir Pode-se avaliar injria mitocondrial. HepG2 (clula de hepatocarcinoma) Estudos gerais de potencial de citotoxicidade. capacidade de metabolismo; Clulas em proliferao. HepaRG (seleo clonal da HepG2) e THLE Hepatotoxicidade XU; HOFFMASTER, 2011 HIAT (Ensaio de Tecnologia de Imagem do Hepatcito) Indica frmaco hepatotxicos; Baixo ndice de falso-positivo. Genotoxicidade WAKMSLEY; ELDERM 2011 Dano ao DNA pode tomar propores catastrficas. Dano oxidativo Modifica as bases induzindo a erros de replicao e quebra da dupla hlice. Ligao do xenobionte ao DNA Metilao das bases A alquilao rotineira, mas a metilao pode induzir quebra da dupla hlice. Hidrlise Depurinizao, depirimidinao, e deaminao. Erro no reparo, mutao/dano. Genotoxicidade WAKMSLEY; ELDERM 2011 Estudo in vitro em clulas humanas e em bactrias Bactrias so menos complexas: No apresenta membrana que reveste o ncleo; Menor empacotamento do DNA; nico cromossomo circular. Alvos especficos podem no estar presentes em todas as linhagens de clulas eucariticas Mutao gnica Dano cromossomal Induo expresso gnica Genotoxicidade: Ensaio Cometa RIBEIRO et al., 2007; WAKMSLEY; ELDERM 2011 Eletroforese do contedo nuclear de clulas A cabea contem grande quantidade enovelada de DNA. Calda contem pores onde houve pelo menos a quebra de uma das duas hlices do DNA. Estudos in vitro A dificuldade em predizer a toxicidade em humanos reside no mecanismo toxicolgico nico de cada NCE. ASTASHKINA; MANN; GRAINGER, 2012 A toxicidade de frmacos in vivo uma sequencia de eventos multifatoriais, dinmico, e complexo. O processo que leva ao dano, como resultado da exposio farmacolgica, pode variar significantemente, ou ser especfica para cada rgo, e envolver interaes entre clulas e frmaco, metablitos e conjugados frmacos- protena. Frmaco Retirados do Mercado ASTASHKINA; MANN; GRAINGER, 2012 Terfenadina Frmaco antihistamnico retirado do mercado por causar toxicidade cardaca ASTASHKINA; MANN; GRAINGER, 2012; ZHOU, 2008 Inibio da CYP2J2 enzima reguladora do tonus vascular e de eventos anti-apoptticos. Modelos in vivo Distribuio especfica de CYP, distribuio do frmaco, taxa de reaes de fase I, e via preferencial de fase II variam significativamente em roedores, coelhos, ces, e humanos. DORATO; BUCKLEY, 2001 Ainda o modelo que melhor possibilita verificao da interao entre mecanismos em rgos diversos. Concluso Modelos in vitro podem dar noo da capacidade toxicolgica de NCE, mas existe necessidade de realizao de diversos ensaios especficos. no eliminando a necessidade de ensaios in vivo. Existe grande variao entre espcies, o que, s vezes, dificulta a extrapolao dos dados in vivo para humanos, principalmente a respeito de dose txica. Apesar das desvantagens, a combinao destes ensaios imprescindvel para avaliao pr-clnica dos NCEs. hERG K + Channels (I Kr ) Bloqueio destes canais: Altera a repolarizao ventricular, prolongando o intervalo QT. Vulnerabilidade para o desenvolvimento de taquiarritmias do tipo torsades de pointes e morte sbita.
Canais de potssio formados por subunidades individuais codificadas pelo gene Human ether- a- go- go- related gene (hERG) Conduzem corrente responsvel pela repolarizao no fim do intervalo QT (fase 3) hERG K + Channels (I Kr )
Apesar de terem stios de ligao com formas caractersticas e carter hidrofbico, os canais hERG interagem com farmacos, das mais variadas estruturas.
Dentre estes frmacos, encontram-se antibacterianos, antifngicos, antipsicticos e antivirais.
Interaes frmaco-frmaco: Podem aumentar os nveis plasmticos de bloqueadores dos canais hERG.
Como regra geral:
Intervalo de segurana > 30 x hERG IC 50 / Cmx esperada do composto Muitas organizaes se direcionam, para a predio das propriedades ADMET j nos primeiros passos: Fail fast, fail cheap Modelos de 1 a gerao: Regra dos 5 de Lipinski
Modelos de 2 a gerao: Parmetros farmacocinticos
Modelos de 3 a gerao: Metabolismo de xenobiticos Avaliao toxicidade de canais hERG
Clamp de voltagem - PADRO OURO Patch Clamp Planar patch clamp Ensaios com marcadores de fluorescncia
http://www.currentprotocols.com/WileyCDA/CPUnit/refId-ph1008.html Modelagem por Homologia Um modelo tridimensional da sequncia protena criado baseado em estruturas homlogas. Estruturas atmicas disponveis: Canais de K + de bactrias KcsA (fechado) e MthK (aberto)
KvAP Modelagem por Homologia QSAR
Identificao e quantificao das propiedas fsico- qumicas de um frmaco e relao destas com atividade biolgica.
Assim, pode-se estabelecer uma relao que permite a determinao de propriedades que desempenham um papel inportante na farmacocintica ou no mecanismo de ao. QSAR 1 o farmacforo sugerido por Ekins et al: 15molculas de literaturas 4 grupamentos hidrofficos; 1 grupamento de carter ionizvel positivo.
Predio de IC 50 de 22 frmacos, a maioria antipsicticos, conhecidos por inibir hERG.
Expanso para 66 molculas: R=0,90 R=0,83 R=0,86 Adio de mais 25 molculas da literatura diminuiu o ndice de confiabilidade, obtendo um valor de correlao R=0,67. QSAR Cavalli et al, Farmacforo a partir de 31 molculas da literatura conhecidas como por prolongarem o intervalo QT 3 grupamentos aromticos ligados a uma amina terciria
Predio de IC 50 6 frmacos da literatura
R=0,952 R=0,744 QSAR Pearsten et al, Modelo baseado em dados de um patch clamp in house de 28 compostos, 18 deles eram anlogos do Sertindol: QSAR Keseru, 55 compostos da literatura para criar um modelo de QSAR baseado em 5 descritores: CLog P Refrao molar calculada rea de superfcie negativa Polarizabilidade Hidrofobicidade
Modelo testado com 13 compostos para validao R= 0,94 R= 0,56 Mtodos de Classificao
Distribuio dos frmacos em classes ou categorias baseadas em alguma observao funcional.
Compostos foram separados em ativos e inativos em relao ao bloqueio de hERG: Mtodos de Classificao Roche et al: Modelo com 244 compostos: diversas tcnicas de classificao. A tcnica mais precisa para a classificao foi baseada numa rede neural artificial. Para a validao, 95 compostos (57 com valores IC 50 obtidos in house e 38 com valores da literatura) foram avaliados. 93% dos compostos inativos e 71% dos ativos foram classificados corretamente.
Buyck et al, Experimentos in house, avaliando caracteristicas fisico-qumicas. Fatores sugestivos de inibidores de hERG: Clog P3,7; 110CRM* <176 e pKa mx 7,3.
*Refrao molar calculada Mtodos de Classificao Aronov e Goldman, 3 pontos para verificao de farmacforos bloqueadores de hERG. Consideraes Estruturais 1) A afinidade dos canais hERG decrescem significativamente com agente bloqueadores quando h ligantes polares e de baixo peso molecular. Possivelmente relacionado ao carter lipoflico dos canais hERG e pela largura de seus poros. Consideraes Estruturais
2) Grupamentos bsicos solveis ou nitrognio positivamente carregado aumenta a afinidade do bloqueador pelos canais hERG.
3) Flexibilidade da molcula inibidora ajuda os ligantes a encontrarem uma conformao compatvel para os diversos ligantes dos canais hERG.
4) O arranjo dos ligantes em meta ou para parecem menos ativos como bloqueadores hERG. A colocao do grupo solubilizante, se presente, pode ter um forte impacto sobre os canais hERG.
Referncias ASTASHKINA, A.; MANN, B.; GRAINGER, D. W. A critical evaluation of in vitro cell culture models for high-throughput drug screening and toxicity. Pharmacology & Therapeutics, v. 134, p. 82-106, 2012.
DORATO, M. A.; BUCKLEY, L. A. Toxicology testing in drug discovery and development. Current Protocols in Toxicology, San Diego: John Wiley & Sons, Inc. 2001.
KERNS, E. H.; DI, L. Drug-like properties: Concepts, structure design and methods: from ADME to toxicity optimization. 1. ed. San Diego: Academic Press. 2008, 549 p.
RIBEIRO, M. L.; PRIOLLI, D. G.; MIRANDA, D. D. C.; PAIVA, D. A.; PEDRAZZOLI JNIOR, J.; MARTINEZ, C. A. R. Avaliao do dano oxidativo ao DNA de clulas normais e neoplsicas da mucosa clica de doentes com cncer colorretal. Revista Brasileira de Coloproctologia, v. 27, p. 391-402, 2007.
XU, J. J.; HOFFMASTER, K. Genetic Toxicity: in vitro approaches for medicinal chemists. In:TSAIOUN, K.; KATES, S. A. ADMET for medicinal chemists: a practical guide. 1. ed. New Jersey: John Wiley & Son, Inc. 2011. 524 p. Referncias WALMSLEY, R. M.; ELDER, D. Hepatic Toxicity. In:TSAIOUN, K.; KATES, S. A. ADMET for medicinal chemists: a practical guide. 1. ed. New Jersey: John Wiley & Son, Inc. 2011. 524 p.
WANG, J.; URBAN, L.; BOJANIC, D. Maximising use of in vitro ADMET tools to predict in vivo bioavailability and safety. Expert Opinion on Drug Metabolism and Toxicology, v. 3, p. 641-665, 2007.
ZHOU, S. F. Drug behave as substrates, inhibitors and inducers of human cytochrome P450 24. Current Drug Metabolism, v. 9, p. 310-322, 2008.