CINTICA ENZIMTICA

2012
CINTICA ENZIMTICA
La cintica enzimtica estudia la velocidad
de las reacciones qumicas que son
catalizadas por las enzimas. El estudio de
la cintica de una enzima permite explicar
los detalles de su mecanismo cataltico, su
papel en el metabolismo, cmo es
controlada su actividad en la clula y cmo
puede ser inhibida su actividad por
frmacos o venenos o potenciada por otro
tipo de molculas.
Las enzimas son protenas
(macromolculas) con la capacidad de
manipular otras molculas, denominadas
sustratos. Un sustrato es capaz de unirse
al centro cataltico de la enzima que lo
reconozca y transformarse en un producto
a lo largo de una serie de pasos
denominados mecanismo enzimtico.
Algunas enzimas pueden unir varios
sustratos diferentes y/o liberar diversos
productos, como es el caso de las
proteasas al romper una protena en dos
polipptidos. En otros casos, se produce
la unin simultnea de dos sustratos,
como en el caso de la ADN polimerasa,
que es capaz de incorporar un nucletido
(sustrato 1) a una hebra de ADN (sustrato
2).
Aunque todos estos mecanismos suelen
seguir una compleja serie de pasos,
tambin suelen presentar una etapa
limitante que determina la velocidad final
de toda la reaccin. Esta etapa limitante
puede consistir en una reaccin qumica o
en un cambio conformacional de la
enzima o del sustrato.
FATORES QUE INTERVIENEN EN
REACCIONES QUMICAS CATALIZADOS POR
ENZIMAS
1. CONTACTO ENTRE ENZIMA
SUSTRATO
Hecho de gran importancia sobre todo en
la digestin donde sta depende de la
mezcla de los alimentos con la enzima.
Ejemplo: en caso de las grasas su
digestin se facilita enormemente por la
emulsificacin lo cual proporciona un
rea mayor de contacto con las lipasas.

2. EFECTO DEL TIEMPO SOBRE LA
ACTIVIDAD ENZIMTICA
De acuerdo al transcurso del tiempo
veremos la desaparicin del sustrato o la
aparicin de algunos de los productos de
la reaccin.
TIEMPO
CONCENTR
ACIN DE
PRODUCTO
Despus de cierto tiempo la actividad disminuye y la curva tiende a
aplanarse
CURVA DE ACTIVIDAD ENZIMTICA MEDIDA COMO APARICIN
DE UN PRODUCTO EN FUNCIN DEL TIEMPO DE LA REACCIN
3. EFECTO DE LA CONCENTRACIN DE
LA ENZIMA Y DEL SUSTRATO
La cantidad de enzima presente no
determina el equilibrio final de la reaccin
que catalizan; solamente modifica el
tiempo en que ste se alcance.

Si se da suficiente tiempo, una pequea
cantidad de enzima produce el mismo cambio
que una cantidad grande.
La velocidad de accin de una enzima est
tambin influenciada con la concentracin de
sustrato. Para una cierta cantidad de enzima la
velocidad de accin aumenta a medida que
aumentamos la concentracin de sustrato hasta
llegar a un cierto nivel, en el cual se mantiene
constante.
Ejemplo: curva de Michaelis.
0
6
12
X
V/2
Y
VELOCIDAD
DE
REACCIN
CONCENTRACIN DE SUSTRATO
Km
En esta grfica donde se obtiene la curva
de Michaelis se puede observar que a
concentraciones bajas de sustrato (hasta
Y de la figura) la velocidad aumenta al
aumentar la concentracin de sustrato;
cuando sta sobrepasa el valor de y la
velocidad de reaccin llega a un valor
mximo o velocidad limitante de la
reaccin.
Las ecuaciones de la cintica de la
reaccin enzimtica nos da como
resultado el valor de una constante Km
que se conoce como constante de
Michaelis.
CONSTANTE DE MICHAELIS
La constante de Michaelis-Menten (KM)
es un parmetro cintico importante en la
cual podemos definir como la
concentracin del sustrato en la que la
velocidad de la reaccin es la mitad de la
velocidad mxima V.

El valor de KM da idea de la afinidad del enzima por el
sustrato: A menor KM, mayor afinidad del enzima por
el sustrato, y a mayor KM, menor afinidad.
Michaelis y Menten dedujeron la siguiente
ecuacin
KM = vmax 1
V


S
La representacin grfica de la
ecuacin de Michaelis-Menten
(v0 frente a [S]0) es una
hiprbola (Figura de la
izquierda). La Vmax
corresponde al valor mximo al
que tiende la curva
experimental, y la KM
corresponde a la concentracin
de sustrato a la cual la
velocidad de la reaccin es la
mitad de la Vmax
MODELO LINEWEAVER-BURK
Una transformacin lineal alternativa de la
ecuacin de Michaelis-Meltem es la de Eadie-
Hofstee:





Cuando V/[S] se representa en el eje de las Y
versus V en el eje de las X, el resultado es un
cuadro lineal con una inclinacin de 1/Km y el
valor Vmax/Km es el intercepto en el eje de las Y
y Vmax es el intercepto en el eje de las X.

Las transformaciones de Lineweaver-Burk y
Eadie-Hofstee de la ecuacin de Michaelis-
Menten son tiles para el anlisis de la
inhibicin Enzimtica. Debido a que la mayora
de la terapia farmacolgica clnica se basa en la
inhibicin de la actividad Enzimtica, el anlisis
de las reacciones enzimticas utilizando las
herramientas descritas anteriormente ha sido
fundamental para el diseo moderno de
frmacos.
Ejemplos bien conocidos de tales terapias incluyen
el uso de metotrexate en la quimioterapia del
cncer para inhibir semi-selectivamente la sntesis
de DNA de las clulas malignas, el uso de la
aspirina para inhibir la sntesis de prostaglandinas
que son al menos parcialmente responsables de
los dolores de la artritis, y el uso de sulfas para
inhibir la sntesis del acido flico que es esencial
para el metabolismo y crecimiento de bacterias
patgenas. Adems, muchos venenos, como el
cianuro, el monxido de carbono y lo bifenoles
policlorinados (PCB) causan sus efectos letales
por la inhibicin de enzimas.
DIFERENCIA ENTRE UNA REACCIN
CATALIZADA POR ENZIMA Y OTRA NO
CATALIZADA
En la reaccin qumica no catalizada por enzima
la velocidad de reaccin aumenta
proporcionalmente a la concentracin de las
sustancias reaccionantes.
En cambio en reacciones catalizadas por
enzimas la velocidad de reaccin aumenta
proporcionalmente a la concentracin del
sustrato, pero solo en un rango pequeo; al
seguir aumentando la concentracin del sustrato
la velocidad de reaccin no aumenta
proporcionalmente, y llega alcanzar una situacin
en la que aumentos importantes en la
concentracin del sustrato no modifica la
velocidad de reaccin.
VELOCIDAD DE
REACCIN
CONCENTRACIN
DE REACTIVOS
REACCIN NO
CATALIZADA
REACCIN
CATALIZADA POR
ENZIMAS
4. EFECTO DE LA TEMPERATURA
El aumento de la temperatura aumenta la
velocidad de la reaccin enzimtica, al
mismo tiempo aumenta tambin la
desnaturalizacin de la enzima como
protena que es.
Si se diminuye la temperatura, disminuye
la velocidad de las reacciones enzimticas;
a 0C la mayora de las enzimas no
funciona.
Existe un valor de temperatura ptima cercano a
los 37C donde la actividad es mxima.
Al elevar la temperatura a 60C la mayora se
inactiva, hirviendo a 100C se destruyen casi
invariablemente.
La desnaturalizacin implica un cambio en el
arreglo de las cadenas polipeptdicas de manera
que cambia la disposicin relativa de los centros
activos y se pierde la estructura especial que
debe existir para que se forme el complejo ES.
5. EFECTO DEL pH SOBRE LAS
REACCIONES ENZIMTICAS.
Cada enzima tiene un pH ptimo, a partir
de esto a cada lado la actividad baja.
Ejemplo: para la pepsina el pH ptimo es
de 1.5 a 2.5, para tripsina de 8 a 11
Pero sin embargo muchas enzimas tienen
un pH ptimo cercano a la neutralidad.
7 6 8
pH
ACTIVIDAD
ENZIMTICA
DADAS COMO
VELOCIDAD DE
REACCIN
TIPO DE ENZIMA ENZIMA Y ORIGEN pH PTIMO
PROTEASA Pepsina
Tripsina
Erepsina
1.5
8
7.7
AMILASA Ptialina
Pancretica
Demalta
6.9
7
5.2
LIPASA Pancretica
Gstrica
8
6
FOSFATASA De huevo
Vegetal
9.5
3.6 - 6
6. ACTIVADORES Y COENZIMAS
Activadores son sustancias que actan de
manera especfica activando la actividad
de un sistema enzimtico. Ejemplo: Cloro,
Magnesio, Quinasa.
Coenzimas: cofactor orgnico no proteico
termoestable que se une a la coenzima,
son menos especficos que enzimas.
7. INHIBIDORES DE LA ACCIN
ENZIMTICA
Los inhibidores enzimticos se clasifican
en dos clases amplias: aquellos que
causan inactivacin irreversible de las
enzimas y los que sus efectos inhibitorios
pueden revertirse. Los inhibidores
irreversibles usualmente causan una
modificacin covalente inhibitoria de la
estructura enzimtica.
El cianuro es un ejemplo clsico de
inhibidor irreversible de enzima: al unirse
en forma covalente a la citocromo oxidasa
mitocondrial, el cianuro inhibe todas las
reacciones asociadas con el transporte de
electrones.
El efecto cintico de los inhibidores
irreversibles es disminuir la concentracin
de enzima activa, disminuyendo as las
concentraciones mximas posibles del
complejo ES.
Debido a que la velocidad de actividad
enzimtica limitante es frecuentemente
K2[ES], es claro que bajo estas
circunstancias la disminucin en la
concentracin de la enzima llevara a una
disminucin en la velocidad de la reaccin.
Los inhibidores reversibles se pueden
dividir en dos categoras principales;
inhibidores competitivos e inhibidores no
competitivos, y una tercera categora que
rara vez se encuentra los inhibidores que
no compiten.
Tipo de
Inhibi
dor
Sitio de unin en la Enzima Efecto cintico
Inhibidor
comp
etitivo
Especficamente al sitio activo, en
donde compite con el sustrato en
un proceso dinmico de
equilibrio. La inhibicin es
reversible por el sustrato
V
max
no cambia; el K
m
esta
incrementado, definido por la [S]
que se requiere para llegar a la
de la actividad mxima de a
reaccin
Inhibidor
no
comp
etitivo
Se une a la E o al complejo ES en
un sitio diferente al sitio activo. La
unin al sustrato no se altera,
pero el complejo ESI no puede
producir producto. La inhibicin
no puede revertirse por el
sustrato
La K
m
no esta alterada. la V
max

disminuye proporcionalmente a
la concentracin del inhibidor
Inhibidor
que
no
compi
te
Se une solamente al complejo ES
en sitios distintos al cataltico. La
unin del sustrato modifica la
estructura de la enzima, haciendo
posible la unin del inhibidor. La
inhibicin no puede revertirse por
el sustrato.
Aparentemente la V
max
esta
disminuida; la K
m
esta
disminuida, definida por la [S]
que se requiere para llegar a la
de la actividad mxima de a
reaccin
La caracterstica de los inhibidores
reversibles es que cuando las
concentraciones del inhibidor caen, la
actividad de la enzima se regenera.
Usualmente estos inhibidores se unen a
las enzimas por fuerzas no covalentes y el
inhibidor mantiene un equilibrio reversible
con la enzima.
KM
1
2
3
INHIBIDOR NO COMPETITIVO EN UNA REACCIN
CATALIZADA POR ENZIMA
CURVA 1: Representa la reaccin en ausencia de inhibidores
CURVA 2 Y 3: representa reaccin en presencia de inhibidores no competitivos
Observe que el efecto reside en una disminucin de la velocidad mxima. Pero
que el KM en cada caso es idntica, o sea que la concentracin de sustrato para
obtener la mitad de la velocidad mxima para cada caso no se modifica
ENZIMAS ALOSTRICAS
Hay enzimas cuya actividad est en
funcin de la concentracin de sustrato y
nos da curvas del tipo S itlica
Hay enzimas que no obedecen la ecuacin de Michaelis-
Menten. Se dice que su cintica no es Michaeliana. Esto
ocurre con los enzimas alostricos, cuya grfica v frente a [S]
no es una hiprbola, sino una sigmoide. En la cintica
sigmoidea, pequeas variaciones en la [S] en una zona crtica
(cercana a la KM) se traduce en grandes variaciones en la
velocidad de reaccin.
Las enzimas con un comportamiento
alostrico muestran una dependencia
sigmoidal de la velocidad de reaccin (V)
en funcin de la concentracin de sustrato
(S).
Un grupo de enzimas que no obedecen la
cintica de Michaelis-Menten son las
enzimas alostricas, estas enzimas tienen
varias subunidades y varios sitios activos.
En las enzimas alostricas la unin de un
sustrato a un sitio activo puede afectar las
propiedades de otros sitios activos en la
misma molcula. Un posible resultado de
esta interaccin entre subunidades es que
la unin del sustrato resulte cooperativo,
es decir que la unin del sustrato en un
sitio activo facilita la unin de los otros
sustratos en los sitios activos vecinos.
Adems la actividad de una enzima alostrica
puede ser alterada por molculas regulatorias
que se unan de manera reversible a sitios sobre
la protena que se encuentren en sitios
diferentes al sitio activos. As, las propiedades
catalticas de las enzimas alostricas pueden
ajustarse para cumplir con las demandas
inmediatas de la clula. Debido a ello las
enzimas alostricas son los puntos clave de
regulacin de las vas metablicas.

REGULACIN ALOSTRICA
Ciertas enzimas catalticas son reguladas
por efectos alostricos de peso molecular
bajo. Ejemplo: Aspartato
Transcarbamilasa que participa en la
biosntesis de las Pirimidinas. La
Aspartato Transcarbamilasa es inhibido
por la Citidin Trifosfato.
REGULACIN DE LA ACTIVIDAD
ENZIMTICA
As como esta claro que las enzimas son
responsables de las catlisis de casi todas
las reacciones bioqumicas, es importante
tambin reconocer que rara vez, (si
alguna pasa) las reacciones enzimticas
suceden en forma aislada.
El escenario ms comn es que las
enzimas catalizan pasos individuales en
vas metablicas que tienen mltiples
pasos, como es el caso de la gliclisis,
gluconeognesis o la sntesis de cidos
grasos. Como consecuencia de esta
secuencia de reacciones, cualquier enzima
depende de la actividad de reacciones
precedentes para su sustrato.
En los humanos, la concentracin del
sustrato depende en la fuente de comida y
usualmente no es un mecanismo
fisiolgico importante para la regulacin
de rutina de la actividad Enzimtica. Por
otro lado, la concentracin de la enzima
es modulada continuamente en respuesta
a las necesidades fisiolgicas.
Se conocen tres mecanismos principales para
regular la concentracin de enzimas activas en
los tejidos:
1. La regulacin de la expresin de genes controla
la cantidad y proporcin de la sntesis
Enzimtica.
2. La actividad proteolca determina la proporcin
de degradacin Enzimtica.
3. Modificaciones covalentes de pro enzimas
inactivas pre-existentes producen enzimas
activas.

La sntesis y degradacin de las enzimas
son mecanismos relativamente lentos
para regular la concentracin de las
enzimas, con respuesta de horas, das o
aun semanas. La activacin de pro
enzimas es un mtodo ms rpido para
incrementar la actividad Enzimtica pero,
como mecanismo regulador, tiene la
desventaja de no ser un proceso
reversible.
Generalmente las pro enzimas se
sintetizan en abundancia, se almacenan
en grnulos secretorios y se activan
covalentemente luego de que han sido
liberadas de su sitio de almacenamiento.
Algunos ejemplos de pro enzimas
importantes son el pepsingeno,
tripsingeno, y quimiotripsingeno, que
dan origen a enzimas proteolticas
digestivas.
De manera similar, muchas de las
protenas involucradas en la cascada de la
coagulacin se sintetizan como pro
enzimas. Otras protenas importantes,
como las hormonas peptdicas y el
colgeno, tambin se derivan por
modificaciones covalentes de sus
precursores.
LAS ENZIMAS EN EL DIAGNSTICO
DE ENFERMEDADES
Se ha demostrado que la determinacin de los
niveles sricos de varias enzimas es de
importancia clnica. Esto es porque la presencia
de estas enzimas en el suero indica que ha
ocurrido dao tisular o celular, lo que resulta en
la liberacin de los componentes intracelulares
a la sangre. Por lo tanto, cuando un mdico
indica que l va a medir las enzimas del hgado,
el propsito es comprobar el potencial dao de
las clulas del hgado.
. Las enzimas comnmente analizadas son las
aminotransferasas: transaminasa de alanina,
ALT (algunas veces llamada aun glutamato-
piruvato aminotransaminasa srica, sGPT), y la
aspartato aminotransaminasa, AST (algunas
veces llamada aun glutamato-oxaloacetato
aminotransaminasa srica, sGOT); lactato
deshidrogenasa, LDH; creatin cinasa, CK
(tambin llamada creatin-fosfocinasa, CPK);
gamma-glutamil transpeptidasa, GGT.
Las enzimas hepticas tpicas que se
determinan son la AST y la ALT. La ALT
es diagnostico de dao heptico porque
esta enzima se encuentra
predominantemente en los hepatocitos.
Cuando se miden ambas la AST y la ALT
el radio de los niveles de estas enzimas
tambin puede ser de diagnostico.
Normalmente en el dao o la enfermedad
hepticos que no es de origen viral el
radio de ALT/AST es menor a 1. Sin
embargo, con la hepatitis viral el radio
ALT/AST ser mayor a 1. La medicin de
la AST es util no solamente para detectar
dao heptico sino tambin para detectar
dao o enfermedad cardiaca.
El incremento del nivel de AST en el suero
es directamente proporcional al nmero de
clulas involucradas as como tambin
tiene relacin con el tiempo transcurrido
luego del dao del tejido hasta la medicin
de la enzima. Luego del dao, los niveles
de AST se incrementan dentro de las
primeras 8 horas y hacen un pico 24 a 36
horas mas tarde.
Dentro de los 3 a 7 das los niveles de
AST deben regresar a los niveles antes
del dao, previendo que no este presente
un dao continuo o que un nuevo insulto
ocurra. Aunque la medicin de AST no es,
en si misma, diagnostico para infarto del
corazn, en conjunto con las mediciones
de LDH y CK (ver abajo), el nivel de AST
es util para determinar el tiempo del
infarto.
La medicin de la LDH es esencial para el diagnostico de
infarto del miocardio porque esta enzima existe en 5
formas muy relacionadas pero poco diferentes (isozimas).
Los 5 isotipos y su distribucin normal y sus niveles en
ausencia de enfermedad o dao se indican como sigue:
LDH 1 se encuentra en el corazn y glbulos rojos y es
17% 27% del nivel srico total
LDH 2 se encuentra en el corazn y glbulos rojos y es
27% 37% del nivel srico total
LDH 3 se encuentra en una variedad de rganos y es
18% 27% del nivel srico total
LDH 4 se encuentra en una variedad de rganos y es
3% 8% del nivel srico total
LDH 5 se encuentra en el hgado y en el msculo
esqueltico y es 0% 5% del nivel srico total

Luego de un infarto cardiaco los niveles sricos de
LDH se incrementan dentro de las 2448 horas
alcanzando un pico a los 23 das y regresan a
valores normales a los 510 das. Especialmente
diagnostico es una comparacin del radio LDH-
1/LDH-2. Normalmente, este radio es menor a 1.
Una reversin de este radio se llama "LDH al
revs". Luego de un infarto agudo del miocardio el
LDH al revs aparecer en 1224 horas y esta
definitivamente presente a las 48 horas en ms del
80% de pacientes. Tambin es importante el hecho
de que en personas que sufren de dolor precordial
debido solamente a angina, estos no tendrn
valores alterados de LDH.
La CPK se encuentra primariamente en
los msculos cardiaco y esqueltico as
como tambin en el cerebro. Por tanto,
las mediciones de los niveles de CPK en
el suero es un buen diagnostico de dao
de estos tejidos. Los niveles de CPK se
incrementaran dentro de las 6 horas
luego del dao y harn un pico alrededor
de las 18 horas. Si el dao no es
persistente el nivel de CK regresa a lo
normal en 2 a 3 das.
Como la LDH, existen isozimas tejido
especficas de CPK y sus designaciones se
indican como sigue:
CPK3 (CPK-MM) es la isozima predominante
en el msculo y es 100% del nivel srico total.
CPK2 (CPK-MB) corresponde al 35% de la
actividad de la CPK en el msculo cardiaco,
pero menos del 5% en el msculo esqueltico y
es el 0% del nivel srico total.
CPK1 (CPK-BB) es la isozima caracterstica del
cerebro y esta en cantidades significativas en el
msculo liso y es el 0% del nivel srico total.
Debido a que la mayora de la CPK
liberada en un infarto del corazn es la
CPK-MB, un radio elevado de CPK-MB a
CPK total puede ayudar en el diagnostico
de un infarto agudo, pero un incremento de
CPK solamente no. Los niveles de CPK-
MB se incrementan 36 horas del infarto
del miocardio y hacen un pico entre las 12
24 horas mas tarde si no hay mas dao y
regresan a valores normales a las 1248
horas luego del infarto.