Prof. Dra.

Viviana Varela
INIGEM, CONICET
Ctedra de Gentica y Biologa Molecular
Fac. Farmacia y Bioqumica U.B.A.
"Aportes de la gentica molecular en la
resolucin de cuadros hematolgicos de
hemoglobinopatas"
eritropatas
-Membranopatas
-Enzimopatas
Hemoglobinopatas
Alteraciones genticas relacionadas a la sntesis de Hb
- grupo ms comn de alteraciones genticas que afectan una sola copia de
un gen.
-se estima que el 5,2 % de la poblacin mundial es portadora de una o ms
mutaciones.
-cada ao nacen ms de 330 000 nios afectados
-83% de casos de anemia de falciforme
-17% de casos de talasemia
-extraordinaria riqueza: ms de 1500 variantes descriptas
HbVar: A Database of Human Hemoglobin Variants and Thalassemias
Se debera informar a los portadores y a las parejas en riesgo de ese peligro y
de las opciones para mitigarlo. El screening de las hemoglobinopatas debera
formar parte de los servicios bsicos de salud en la mayora de los pases.
MODELL, B et all. Global epidemiology of haemoglobin disorders and derived service indicators.
Bull World Health Organ, Genebra, v. 86, n. 6, June 2008 .
1910-1925: descripcin de la patologa (Hb S) talasemia
1949: 1 protena anmala (Hb S) asociada a enfermedad hereditaria
1956: 1 mutacin puntual humana identificada
Hb S -codn 6: glutmico valina
1976: 1 gen humano clonado: |-globina
1 organizacin de una familia de genes: familia o y |
1 pseudogen descubierto: |
1 diagnstico prenatal por hibridacin molecular
1988: 1 gen humano expresado por terapia gnica

2010: descubrimiento de regulacin de expresin del cluster BETA
Es un modelo privilegiado en gentica molecular
cromosoma 11
cromosoma 16
c G A +| o |
familia |
familia o
, , o2 o2 o1 u
Hb A
NH2 COOH
E1 E2 E3
i1 i2
ARNm
GLOBINA
transcripto primario
5 3
capping 5
splicing
poli A 3
54 93 222 126 135
130 850
gen de |-globina: HBB
130 31 104 105 146
-protena: 146 aminocidos
gen de o-globina: HBA
37 93 204 126 112
113 141
131 32 99 100 141
- protena: 141 aminocidos
gen ancestral - 800 mill. aos
- 600
- 450
- 200
- 40
- 150
mioglobina , o2o1 u c o |
crom. 16 crom. 11
PAT. HEREDITARIA
(mutaciones germinales)
M
M
M
M
M
ADN nuclear
genoma: 6 x 10
9
pb
46 cromosomas
44 autosomas
2 sexuales
30.000 genes
herencia mendeliana
segregacin meitica
G
e
n

P
a
t
e
r
n
o

Homocigota


Normal
Heterocigota


Normal (Portador)
Homocigota


Enfermo
Doble Heterocigota


Enfermo
G
e
n

P
a
t
e
r
n
o

G
e
n

P
a
t
e
r
n
o

G
e
n

P
a
t
e
r
n
o

genotipo
fenotipo
: Mutacin
PATOLOGA HEREDITARIA RECESIVA
G
e
n

P
a
t
e
r
n
o

Homocigota


Normal
Heterocigota


Enfermo
Homocigota


Enfermo
Doble Heterocigota


Enfermo
G
e
n

P
a
t
e
r
n
o

G
e
n

P
a
t
e
r
n
o

G
e
n

P
a
t
e
r
n
o

genotipo
fenotipo
: Mutacin
PATOLOGA HEREDITARIA DOMINANTE
>AUTOSMICAS

>MONOGNICAS
+monoallicas

drepanocitosis
PATOLOGA HEREDITARIA
+poliallicas

hemoglobinopatas
HEMOGLOBINOPATAS
Exgenas: infecciones, intoxicaciones, nutricionales....

Segn el tipo Germinales
de clula Somticas (cncer)


Cromosmicas numricas
Segn el tipo de estructurales
alteracin
Gnicas mutaciones puntuales
inserciones y deleciones

Segn el genoma Nucleares autosmicas
y cromosoma ligadas al sexo
afectados
Mitocondrial

Complejas o multifactoriales: en parte exgenas y en parte genticas
Genticas
Nomenclatura de los genes
familia o
, , o1 o2 o1 u
HBZ HBZP HBM HBAP1 HBA2 HBA1 HBQ1
Ref Seq: NG_000006.1
c G A +| o |
familia |
HBE HBG2 HBG1 HBBP1 HBD HBB
Ref Seq: NG_000007.3
o

o
c
c G A +| o |
familia |
familia o
, , o1 o2 o1 u
|
50
30
10
%
-6 -3 0 3 6 meses
Gower 1: ,2/c2
Gower 2: o2/c2
Portland: ,2/2
Hb Fetal:o2/2

Hb A: o2/|2
Hb A
2
: o2 /o2
,
Thalassaemia. DR Higgs, JD Engel, G Stamatoyannopoulos. The Lancet, 379 (9813): 373 - 383, 2012
Thalassaemia. DR Higgs, JD Engel, G Stamatoyannopoulos. The Lancet, 379 (9813): 373 - 383, 2012
Control de expresin gnica en vida fetal y
adultos cluster de |-globina
-LCR y genes inertes
-modelo de expresin
secuencial: looping
Hemoglobinopatas estructurales (Variantes):
defecto cualitativo: sntesis de protenas estructuralmente anmalas
(1151 variantes: HBB:571; HBA2: 338; HBA1: 283)
Las mutaciones pueden determinar variaciones en
la calidad y cantidad de Hb:
Talasemias: sindromes talasmicos (alfa y beta)
defecto cuantitativo: menor cantidad de sntesis de globinas
(437 variantes: HBB: 260; HBA2: 61; HBA1: 44)
Hemoglobinopatas talasmicas:
alteraciones cualitativas y cuantitativas a la vez.
(53 variantes) ej. Hb Lepore.
http://globin.cse.psu.edu/hbvar/menu.html
Epidemiologa de hemglobinopatas
Sus orgenes
Harteveld C. and Higgs D. Orphanet J Rare Dis. 2010; 5: 13.
Situacin en Argentina
No ha sido documentada la talasemia en la Amrica precolombina.
Hb S, Hb C: ingreso por trfico de esclavos negros.
Sucesivas corrientes inmigratorias del rea del Mediterrneo:
Aporte colonizador espaol durante el siglo XVI.
1830-1840: llegada de los primeros inmigrantes italianos.
1876-1925 aporte italiano masivo, 60% Italia;1901-1910 47% Espaa. 1 guerra
mundial.
1947-1951: 2.145.000 italianos (881.510 norte, 256.220 centro, 1.007.560 sur).
Finalizacin de la 2guerra mundial ingresan 400.000 inmigrantes en su mayora
del sur de Italia.
Fines del siglo XX: Inmigracin del sudeste asitico
Fenotipo clnico- hematolgico
-mdico clnico: adulto, pediatra
-mdico hematlogo
-laboratorio
-Asesoramiento gentico
-historia familiar
-ascendencia
-consentimiento informado
-Estudios moleculares
-segn fenotipo
-informe claro
-Asesoramiento gentico
-historia familiar
-ascendencia
-consentimiento informado
-Estudios moleculares
-segn fenotipo, etc...
-informe claro
Fenotipo clnco- hematolgico
-mdico clnico: adulto, pediatra
-mdico hematlogo
-laboratorio
?
?
Formas clsicas

formas silentes

anemias

talasemia intermedia
Hb H

talasemia mayor (|)
Sind. de hidropesa fetal (o)
>

G
r
a
v
e
d
a
d

c
l

n
i
c
a
-
h
e
m
a
t
o
l

g
i
c
a

Fenotipo hematolgico
Formas NO clsicas

-variantes raras

-asociacin de mutaciones
ej: talasemias intermedias

-modificadores genticos
Identificacin de
blancos teraputicos
Gentica molecular de
Hemoglobinopatas
estructurales
Hemoglobinopatas estructurales


defecto CUALITATIVO
mutaciones en regiones codificantes
puntuales de cambio de sentido
deleciones o inserciones que no generen pptidos truncados

fenotipo muy variable
depende del cambio estructural
asociacin de mutaciones
modificadores genticos de expresin

herencia > recesiva / dominante

Variantes: HBB: 575; HBA2: 338; HBA1: 284; HBG: 94; HBD: 69.

Diferente frecuencia y distribucin geogrfica
Hemoglobinopatas estructurales
tipificadas en nuestros laboratorios
Hb S |6 glu>val GAG>GTG HBB:c.20A>T
Hb C |6 glu>lys GAG>AAG HBB:c.19G>A
Hb D Los Angeles |121 Glu>Gln HBB:c.364G>C
Hb Redondo |92 His>Asn HBB:c.277C>A
Hb Agenogi |90 Glu>Lys HBB:c.271G>A
Hb Saint-Etienne |92 His>Gln HBB:c.279C>G
Hb Regina |96 Leu>Val HBB:c.289C>G

Hb I-Interlaken o1-15 Gly>Asp HBA1:c.47G>A
Hb Riccarton o1-51 Gly>Ser HBA1:c.154G>A


fenotipos de severidad variable:
>grado de inestabilidad de la cadena
>formar dmeros de globina: al precipitar las cadenas , se produce un
exceso de cadenas (tambin inestables)

mutaciones >cambio de sentido
>deleciones
>corrimiento del marco de lectura > cadenas elongadas

herencia: dominante
Hemoglobinas inestables
-Hb Saint-Etienne (c.279C>G , p.His92Gln)
-Hb M-Saskatoon (c.190C>T, p.His64Tyr)
-Hb Durhan-N.C (c.344T>C, p.Leu114Pro)

2 nuevas deleciones

HBB:c.270_273delTGAC (p.Glu90Cysfs*67)
HBB:c.182_187delTGAAGG (p.Val60_Lys61)
Heterocigotas
Homocigotas

Dobles
heterocigotas
67%
33 %
0
2
4
6
8
10
12
1 2 3
S/|
S/S
S/
otra
0
5
10
15
20
25
30
35
1 2 3 4
S
C
otra
Hb
inestable
Hemoglobinopatas estructurales
tipificadas en nuestros laboratorios
Gentica molecular de
talasemias
familia o
, , o1 o2 o1 u
o

o
c
c G A +| o |
familia |
|
50
30
10
%
-6 -3 0 3 6 meses
Hb Fetal:o2/2

Hb A: o2/|2
Hb A
2
: o2 /o2
,

|
familia o
, , o1 o2 o1 u
o
o
c
c G A +| o |
familia |
50
30
10
%
-6 -3 0 3 6 meses
Hb Fetal:o2/2

Hb A: o2/|2
Hb A
2
: o2 /o2
,
cerca del 100 % de las mutaciones son puntuales y varan en los
distintos grupos poblacionales
Bases moleculares de la |-talasemia
Caractersticas fenotpicas clsicas:
Anemia hemoltica
GR
VCM < 80 fl
HCM < 27 pg
RDW bajo
Hb A
2
aumentada
Parmetros de Fe normales
Cadenas | / o
las mutaciones ms frecuentes son deleciones y varan en
los distintos grupos poblacionales
Bases moleculares de la o-talasemia
Caractersticas fenotpicas:
Anemia variable
GR
VCM < 80 fl
HCM < 27 pg
Hb A
2
normal o disminuida
Parmetros de Fe normales
Cadenas | / o
Mutacin sin sentido: Cod 39 (C>T) |
o

cttagCTGCTGGTGGTCTACCCTTGGACCCAGAGGTTCTTT
Leu Leu Val Val Tyr Pro Trp Thr Gln Arg Phe Phe

cttagCTGCTGGTGGTCTACCCTTGGACCTAGAGGTTCTTT
Leu Leu Val Val Tyr Pro Trp Thr Stop

*
ARNm mutado
*
protena
normal
Activacin de sitio crptico de splicing: Int-1 nt 110 (G>A) |
+
GGCAG gt...................................................................ag GCTG
Splicing normal: ~20%
ag
gg
gt ag
gt ag
GGCAG gt........................ag TCTATTTTCCCACCCTTAGGCTG
Gly Se r Leu Phe Ser His Pro Stop
Splicing alternativo: ~80%
ARNm mutado
protena
Mutacin en regin 5 de splicing: Int-1 nt 6 (T>C) |
+

ARNm mutado
protena
gt ag
GGCAG gttggt..........................ag GGCTG
Ar g
GGCAG gttggcat..................tga....ag GGCTG
Ar gLeuAla................HisStop
Spl.normal
Spl.alternativo
gt ag
Fenotipos hematolgicos - genotipo heterocigota
CODON 39 (C>T)
(|
0
)
GR
5,7 0,7
Hb
11,0 1,2
Hto
34,9 5,5
VCM
62,4 4,3
HCM
19,3 1,6
CHCM
31,8 1,5
RDW <15
HbA
2

4,6 1,7
HbF <2
Fenotipos hematolgicos - genotipo heterocigota
CODON 39 (C>T)
(|
0
)
Int-1 nt 6 (T>C)
(|
+ leve
)
GR
5,7 0,7 5,6 0,7
Hb
11,0 1,2 12,3 1,8
Hto
34,9 5,5 38,3 4,5
VCM
62,4 4,3 70,1 4,3
HCM
19,3 1,6 22,4 2,5
CHCM
31,8 1,5 31,2 2,6
RDW <15 <15
HbA
2

4,6 1,7 3,6 0,6
HbF <2 <2
Fenotipos hematolgicos - genotipo heterocigota
CODON 39 (C>T)
(|
0
)
Int-1 nt 110 (A>G)
(|
+ severa
)
Int-1 nt 6 (T>C)
(|
+ leve
)
GR
5,7 0,7 5,7 1,3 5,6 0,7
Hb
11,0 1,2 11,1 1,6 12,3 1,8
Hto
34,9 5,5 36,0 5,4 38,3 4,5
VCM
62,4 4,3 63,8 3,6 70,1 4,3
HCM
19,3 1,6 19,7 1,6 22,4 2,5
CHCM
31,8 1,5 31,8 1,7 31,2 2,6
RDW <15 <15 <15
HbA
2

4,6 1,7 4,7 1,6 3,6 0,6
HbF <2 <2 <2
Fenotipos hematolgicos - genotipo heterocigota
CODON 39 (C>T)
(|
0
)
Int-1 nt 110 (A>G)
(|
+ severa
)
Int-1 nt 6 (T>C)
(|
+ leve
)
GR
5,7 0,7 5,7 1,3 5,6 0,7
Hb
11,0 1,2 11,1 1,6 12,3 1,8
Hto
34,9 5,5 36,0 5,4 38,3 4,5
VCM
62,4 4,3 63,8 3,6 70,1 4,3
HCM
19,3 1,6 19,7 1,6 22,4 2,5
CHCM
31,8 1,5 31,8 1,7 31,2 2,6
RDW <15 <15 <15
HbA
2

4,6 1,7 4,7 1,6 3,6 0,6
HbF <2 <2 <2
Fenotipos hematolgicos - genotipo heterocigota
CODON 39 (C>T)
(|
0
)
Int-1 nt 110 (A>G)
(|
+ severa
)
Int-1 nt 6 (T>C)
(|
+ leve
)
GR
5,7 0,7 5,7 1,3 5,6 0,7
Hb
11,0 1,2 11,1 1,6 12,3 1,8
Hto
34,9 5,5 36,0 5,4 38,3 4,5
VCM
62,4 4,3 63,8 3,6 70,1 4,3
HCM
19,3 1,6 19,7 1,6 22,4 2,5
CHCM
31,8 1,5 31,8 1,7 31,2 2,6
RDW <15 <15 <15
HbA
2

4,6 1,7 4,7 1,6 3,6 0,6
HbF <2 <2 <2
Fenotipos hematolgicos - genotipo heterocigota
CODON 39 (C>T)
(|
0
)
Int-1 nt 110 (A>G)
(|
+ severa
)
Int-1 nt 6 (T>C)
(|
+ leve
)
GR
5,7 0,7 5,7 1,3 5,6 0,7
Hb
11,0 1,2 11,1 1,6 12,3 1,8
Hto
34,9 5,5 36,0 5,4 38,3 4,5
VCM
62,4 4,3 63,8 3,6 70,1 4,3
HCM
19,3 1,6 19,7 1,6 22,4 2,5
CHCM
31,8 1,5 31,8 1,7 31,2 2,6
RDW <15 <15 <15
HbA
2

4,6 1,7 4,7 1,6 3,6 0,6
HbF <2 <2 <2
> 50 %
HbA
2
- normal
Mutaciones |-tal en 418 familias (518 pacientes)
6 mutaciones: 90,2 % 18 mutaciones: 7,7 %
mutacin N familias %
Cod 39 (C>G) 217 170 40,7
Int 1-110 (G>A) 105 82 19,6
Int 1-6 (T>C) 48 45 10,8
Int 1-1 (G>A) 52 43 10,3
Int 2-745 (C>G) 21 20 4,8
Int 2-1 (G>A) 26 17 4,1
o|
0
-tal Siciliana 14 10 2,4
mutacin N familias %
(-87) (C>G) 6 6 1,4
(-56) (G>C) 1 1 0,2
Cod 6 (-A) 6 6 1,4
Cod 11 (-T) 1 1 0,2
Cod 15 (G>A) 2 1 0,2
Cod 29 (C>T) 2 2 0,5
Cod 30 (G>C) 2 2 0,5
Int 1-2 (T>A) 1 1 0,2
Int 1-5 (G>C) 2 2 0,5
Cod 41/42 (delCTTT) 1 1 0,2
Cod 44 (-C) 3 2 0,5
Int 2-654 (C>T) 1 1 0,2
Int 2-705 (T>G) 1 1 0,2
Int 2-726 (A>G) 1 1 0,2
Hb Durhan
N.C.(c.344T>C)
2 1 0,2
c.*96T>C 1 1 0,2
Delecin de 13.400 pb
fenotipo: talasemia mayor (31 pacientes)
+ 17 parejas heterocigotas con mutaciones identificadas en el
marco de asesoramiento gentico familiar
Genotipo N pacientes
Cod 39 / Cod 39 5
Int 1-110 / Int 1-110 4
Int 2-745 / Int 2-745 1
Cod 39 / otra 8
Int 1-110 / otra 4
Otra / otra 5
Mut. heterocigota
dominante
1
Genotipos
homocigotas
Genotipos dobles
heterocigotas
Diagnstico molecular de mutaciones puntuales
PCR - RFLP: Diagnstico de Hb S - desaparece sitio Dde I
P H1 H2 M
P
M
H1 H2
-350
-201
-149
-88-89
149 201 88 89 9
Ex.1 Ex.2
Diagnstico molecular de mutaciones puntuales
PCR Dot Blot: mutaciones en HBB
Diagnstico molecular de
mutaciones puntuales
PCR Dot Blot Reverso: mutaciones |-talasmicas
Diagnstico molecular de mutaciones puntuales
PCR secuenciacin: mutaciones en HBB
PCR PCR en Tiempo Real
Int 1-6 / Int 1-6 Int 1-6 / normal
normal / normal
GENOTIPIFICACIN MEDIANTE PCR EN TIEMPO REAL DE LAS MUTACIONES PARA -
TALASEMIAS MAS FRECUENTES EN NUESTRO MEDIO: CD39, IVS I-6, IVS I-110.
SALIM JP, SCHEPS KG*, BAYO HANZA C, VARELA V*, ZERDIEW A
Laboratorio de Biologa Molecular-HGA E. Torn-GCABA. Ctedra de Gentica y Biologa
Molecular, Fac. Farm. Y Bioq., Universidad de Buenos Aires.*
(o|)
0
-TALASEMIAS
c G A | o |
5 3
(o|)
0
-v. Espaola
114 kb
(o|)
0
- v. Siciliana
13,4 kb
(o|)
0
- v. Turca
20,7 kb
-fenotipo talasmico
-disbalance entre cadenas o y no-o
-grandes deleciones
-ausencia de o- y |-globina (HbA
2
disminuida)
-aumento de -globina (Hb F)

Fenotipo hematolgico de o|
0
-tal
ndices hematimtricos compatibles con |-tal
Electroforesis de Hb: HbA
2
normal o disminuida + | HbF
GR Hto Hb VCM HCM CHCM RDW HbA2 HbF
5,48 34 10,5 62,1 19,6 2,3 5,8
5,32 34,8 10,9 65,4 20,4 1,7 8,4
7,02 45,9 14,2 65,4 20,2 1,9 4,1
7,36 48 15,4 65,2 20,9 1,7 5,8
4,86 33 68 21,8 32,1 21,1 norm 6
Inicialmente, 30 % muestras clasificadas como o|
0
-tal
no presentaban esta delecin
Mutaciones |-tal con HbF |
, , o1 o2 o1 u
-o
3,7
-o
4,2
--
MED
--
FIL
--
SEA
-(o)
20.5
deleciones (o
+
)
deleciones (o
0
)
DELECIONES o-TALASMICAS


oo / oo oo / o o / o oo / o / /
fenotipos
genotipos
normal portador leve portador severo enf. Hb H enf. Hb Bart
, , 1 o 1 o 2 o 1 u
Crossing-over desigual

o 2

o 2

o 1
insercin
o 2

o 1

o 2

o 1
o 2

o 1
o 2

o 1
delecin

o 1
Alelo triple alfa
Genotipo N Fenotipo
o
3,7
/oo 66 o-tal
+
o
3,7
/o
3,7
20 o-tal
0

MED
/oo 6 o-tal
0
--
SEA
/oo 4 o-tal
0
(origen asitico)
-(o)
20.5
/oo 1 o-tal
0
o
3,7
/
MED
1 Hb H
o
3,7
/no tipif. 2 Hb H
ooo
3,7
/oo 17 4 tal intermedias
o
HphI
o/oo 4 o-tal
+

o
NcoI
o/oo 2 o-tal
+

HBA2:c.*+107G>A 1 o-tal
+

Patchwork o212 6 o-tal
+
/ asoc. complejas
HBA1:c.301-A>T 1 o-tal
+
(asoc. compleja)
HBA1:c.187delG(p.W62fsX66) 2 asoc. complejas
Deleciones
(n= 97)
Inserciones
(n= 17)
no
delecionales
(n = 15)
Fenotipos hematolgicos - genotipo heterocigota
o-tal
+
(-o/oo)
GR
4,9 0,5
Hb
13,7 2,0
Hto
37,9 4,0
VCM
77,3 3,2
HCM
24,8 1,3
CHCM
32,1 0,8
RDW
13,7 1,0
HbA
2

2,5 0,3
HbF
0,7 0,3
Fenotipos hematolgicos - genotipo heterocigota
o-tal
+
(-o/oo)
o-tal
0
(-o/-o)
GR
4,9 0,5 5,4 0,5
Hb
13,7 2,0 11,5 1,0
Hto
37,9 4,0 36,4 2,8
VCM
77,3 3,2 68,7 4,0
HCM
24,8 1,3 22,1 0,7
CHCM
32,1 0,8 29,1 4,3
RDW
13,7 1,0
bajo
HbA
2

2,5 0,3 2,3 0,3
HbF
0,7 0,3 0,4 0,2
Fenotipos hematolgicos - genotipo heterocigota
o-tal
+
(-o/oo)
o-tal
0
(-o/-o)
CODON 39
(C>T) (|
0
)
GR
4,9 0,5 5,4 0,5 5,7 0,7
Hb
13,7 2,0 11,5 1,0 11,0 1,2
Hto
37,9 4,0 36,4 2,8 34,9 5,5
VCM
77,3 3,2 68,7 4,0 62,4 4,3
HCM
24,8 1,3 22,1 0,7 19,3 1,6
CHCM
32,1 0,8 29,1 4,3 31,8 1,5
RDW
13,7 1,0
bajo <15
HbA
2

2,5 0,3 2,3 0,3 4,6 1,7
HbF
0,7 0,3 0,4 0,2
<2
Fenotipos hematolgicos - genotipo heterocigota
o-tal
+
(-o/oo)
o-tal
0
(-o/-o)
CODON 39
(C>T) (|
0
)
GR
4,9 0,5 5,4 0,5 5,7 0,7
Hb
13,7 2,0 11,5 1,0 11,0 1,2
Hto
37,9 4,0 36,4 2,8 34,9 5,5
VCM
77,3 3,2 68,7 4,0 62,4 4,3
HCM
24,8 1,3 22,1 0,7 19,3 1,6
CHCM
32,1 0,8 29,1 4,3 31,8 1,5
RDW
13,7 1,0
bajo <15
HbA
2

2,5 0,3 2,3 0,3 4,6 1,7
HbF
0,7 0,3 0,4 0,2
<2
Deteccin molecular de deleciones o-talasmicas
ELECTROFORESIS AUTORRADIOGRAFIA
23,13 Kb

9,41 Kb

6,56 Kb

4,36 Kb

2,32 Kb
2,03 Kb
14,0 Kb
10,3 Kb
Southern blot
oo: 14Kb


-o
3.7
:10,3Kb


| ||
o2 o2 o1 u

Enzima de
restriccin:
BamH I
Deteccin molecular de deleciones o-talasmicas
PCR-GAP
oo: 1803 pb


-o
3.7
: 2022 pb

1: o
3.7
/o
3.7
2: oo/oo
3: o
3.7
/oo
4: o
3.7
/o
3.7

5: --
SEA
/oo
6: --
MED
/oo
+o 1

o 2 o 1

+o 1

o
F R(normal) R (del)
M 1 2 3 4 5 6 M
3560 / 3215/3233
2838 / 2430
2040
1632

1193

841


402
M 1 2 3 4 5 6 M
3560
3215/3233
2838
2430
2040
1632

1193

841


402
3560
3215/3233
2838
2430
2040
1632

1193

841


402
o2-R o2-R
, , o2 o1 o2 o1 u
FIL-F FIL-R 20.5-F 20.5-R MED-F MED-R SEA-F SEA-R 4.2-F 4.2-R 3.7-F 3.7-R
-o
3,7
-o
4,2
deleciones (-o)
--
MED
--
FIL
--
SEA
-(o)
20.5
deleciones (--)
Anlisis de deleciones PCR-GAP
o2-R o2-R
22 43 nts
Hibridan en paralelo ~ 45 sondas
(entre especficas y controles),
cada una constituida por dos
oligonucletidos
complementarios a secuencias
blanco inmediatamente
adyacentes
De longitud variable
para obtener productos
de distinto tamao
Con ligasa
Se usan primers universales, uno
de ellos marcado con un
fluorocromo. La PCR no llega a
punto final sino que se fija un n
de ciclos para que llegue a la
fase exponencial
Los productos de PCR son
sometidos a electroforesis
capilar en secuenciador
automtico. En el
electroferograma resultante
cada pico representa un
amplicn y el rea de ese
pico es proporcional a la
cantidad de producto
MLPA
Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification
Desnaturalizacin
Hibridacin
Ligasa Ligasa
Ligacin
Amplificacin
Separacin de fragmentos por electroforesis capilar
Anlisis de los resultados




Mutacin o
Hph
o - HBA2:c.95+2_95+6delTGAGG
ex. 3
ex. 2
polimorfismo en ex. 2
2,60 15,70 35,00 25,00 72 13,1 39 5,40
0,1 21,70 64,8 9,1 28 4,32
HbF HbA2 RDW CHCM HCM VCM Hb HTO GB
Nio 6 aos
Mujer adulta
PCR-RFLP: se elimina el sitio de restriccin
PCR-secuenciacin
PCR-SSCP
-128 con mutaciones o-tal

-16 con mutaciones |-tal (HbA
2
normal)

-30 fenotipo o-tal sin resolver (2 Hb H)

-20 con genotipos NO clsicos / asociacin de mutaciones
en cluster o

-60 (> 20 %) ndices hematimtricos incorrectos / incompletos
Sobre un total de 250 muestras analizadas:
Entre variantes estructurales: Hb C / Hb S
Hb S / Hb D Los Angeles
Asociacin Variante estructural / |-talasemia:
Hb S / IVS-1 nt 110
Hb S / codn 44 (-C)
Hb C / IVS-1 nt 1
Hb S / codn 11 (-T)
Hb C / codn 39
Hb S / o| talasemia Siciliana
Asociaciones complejas
Asociacin Variante estructural / otalasemia:
Hb S / o
3,7
/oo
Hb S / o
3,7
/ o
3,7
Hb Agenogi / o
3,7
/oo
Asociacin de Hb Riccarton con una nueva mutacin no delecional en HBA1
Scheps et al. Hemoglobin, 2012
VCM: 79,5
HbA2: 2,2
VCM: 79,3
HbA2: 2,0
VCM: 80,6
HbA2: 2
o
P212
o/ -o
3.7

HBA1:c.187delG
HBA1:c.187delG
HbS/HbA
HbS/HbA
HbS/HbS
Patchwork o212o
o
P212
o
M
/ oo

o
P212
o
M
/ oo

Patchwork o212, HBA1delG /oo
o1 HBA2 HBA1
o1 o212 HBA1:c.187delG
genera un codn
de stop prematuro
alelo mutado
alelo normal
HBA1:c.187delG (p.w62fsx66)

TGGCCGACGCGCTG
GGCAAGAAGGTGGCCGACGCGCT
(a)
(c)
(b)
62 66
1 2 3 4 5 6
Scheps et al. Hemoglobin, 2013
Co-Inheritance of a Novel Mutation in the HBA1 Gene:c.187delG (p.W62fsX66)
(Alpha 1 62(-G)) with the o212 Patchwork allele and Hb S.
Scheps et al. Hemoglobin, 2013
C C
G G
T T
C C
A G
T T
C C
C C
T G
C C
G G
T T
C C
A A
T T
C C
C C
T G
Family A Family B Family C
1 2
1
3
NA
1 2
1
I
II
1 2
2
NA NA NA N
o
P212
o
P212
o
delG
-o
3.7
NA: not available for genotyping N: normal
rs115436247 C A
NVS 1(G>A) G G
rs285943 T T
rs4021962 C C
rs202172069 A A
rs200340576 T T
rs187887324 C C
NVS 2 (C>T) C C
rs2362746 T G
1
C A
G G
T T
C C
A A
T T
C C
C C
T G
- C
- A
- T
- C
- G
- T
- C
- T
- G
- C
- A
- T
- C
- G
- T
- C
- T
- G
C C
G G
T T
C C
A G
T T
C C
C C
T G
Fenotipos no clsicos
-ferropenia
-mut. |
+leve
-mut. o-tal asociada
-mut HBD (o-tal)
mutacin |-tal
VCM+ HCM+
Hb A2 |
Hb F normal
Hb A2 normal
Hb F normal
HBB normal
VCM+ HCM+
Hb A2 |
Hb A2 normal
Hb F |
Hb A2 |
Hb F |
Estudiar causas
de Hb F |
-mut. KLF1 (con Hb F |)
-mut HBD
HBB normal
Hb F |
TALASEMIA INTERMEDIA
Mutaciones beta talasmicas (homocigotas o dobles heterocigotas)
2 alelos |
+

1 alelo | tal.+ 1 alelo hemoglobinopata: asociaciones con Hb S, etc.
1 alelo | tal. +1 alelo db tal.
Modificadores genticos de la expresin de Hb F
Polimorfismo -158 G (A>T)
Otras mutaciones en las regiones promotoras de los genes HBG
Determinantes en otros cromosomas BCL11A (crom. 2)
HBS1L-MYB (crom. 6)

Mutaciones beta talasmicas heterocigotas
Herencia con alelos triple o o cuatriplicados
Mutaciones en otros genes (KLF1?)
Genotipo cluster | Genotipo cluster o N
Int 1-6 / Int 1-6 3 2 mut |
+
CD 29 / CD 29 1 2 mut |
+

CD 39 / c.*96T>C oo / oo 1 |
0
/ |
+leve
Int 1-6 / Int 1-110 2 |
+leve
/ |
+severa
???
CD 39 / CD 39 2 Genotipo tal > ???
CD 39 / Int 1-110 1 Genotipo tal > ???
Int 2-745 / normal ooo / oo 3
Int 2-1 / normal ooo / oo 3
CD 39 / normal oooo / oo 3
CD 39 / normal ooo negativo 2 1 mut |
0
???
Int 1-1 / normal ooo negativo 3 1 mut |
0
???
Genotipos en Talasemias Intermedias
ESTRATEGIA GENERAL PARA EL ANALISIS DE MUTACIONES
Evaluacin
Hematolgica
Purificacin de
ADN genmico
cluster de o-globina cluster de |-globina
deleciones
GAP-PCR
mutaciones
puntuales
PCR-ASO
PCR-RFLP
Dot Blot rev.
secuenciacin
Microarrays

Southern blot
GAP-PCR
PCR-inversa
MLPA
deleciones e
inserciones
mutaciones
puntuales
PCR-RFLP
SSCP
secuenciacin
Estudio de modificadores de
expresin!!!!