HISTOQUIMICA DE

ACIDOS NUCLEICOS
PRESENTADO POR:
VASQUEZ ROMAN, Licet
MAMANI QUISPE, Noel
A.N.






FIJACION DE MUESTRA
FORMALINA: No es un buen fijador para los
cidos nucleicos porque bloquean un numero
considerable de grupos reactivos, de tal manera
que se reduce considerablemente la reaccin.
Los fijadores mas recomendables son:
los lquidos a base de alcohol y acido actico.
Fijador de carnoy es el mas popular; sin embargo,
hay que tener presente que la permanencia
prolongada de soluciones acidas tienden a
extraer los cidos nucleicos, primero al ARN y
luego al ADN.
METODO FEULGEN - ROSSENBECK
HISTORIA: Propuesta por Feulgen y Rossenbeck en
1924, es una de las reacciones citohistoquimicas mas
ampliamente utilizadas en la biologa y medicina.
Permite teir el DNA in situ especficamente, basada
en la reaccin del reactivo de Schiff con los grupos
aldehidos generados en las molculas desoxirribosas
por hidrolisis acida (HCL).
El reactivo de Schiff fue desarrollada en 1866.

OBJETIVO: Demostrar presencia de Acido
Desoxiribonucleico.


PASO 1

HIDROLISIS ACIDA: Se utiliza para romper los
puentes de hidrogeno que une a la doble hlice,
mediante la desnaturalizacin de la cadena.

Para esto se utiliza acido clorhdrico que es el
componente reactivo mas critico del mtodo,
controlando la concentracin del acido,
temperatura y tiempo que depende del tipo de
tejido y fijador empleado.
Durante la hidrolisis acida suave la mayor parte del
RNA se divide en sustancias solubles y se pierde del
tejido sin ser removido los grupos ribosil debido a la
presencia de un grupo hidroxilo en la posicin 2 de la
ribosa, por lo que, este material no reacciona
posteriormente con el reactivo de Schiff .
Mientras tanto el DNA es parcialmente hidrolizado
siendo removidas y liberadas las bases puricas (A G)
de los residuos de desoxiribosa (depurinizacion)
formando cidos apurinicos y generando grupos
aldehdo (CHO) en el C1 de la pentosa donde se
encontraba unida la base nitrogenada.
=
Fenmenos moleculares de la
exposicin de DNA a la hidrolisis acida

PASO 2
TINCION CON REACTIVO DE SCHIFF
Los grupos aldehdos por la hidrolisis de Feulgen son
teidos con reactivo de Schiff. Cualquier grupo
aldehdo libre endgeno y preexistente producido por
el fijador, tejido elstico inmaduro o algunos lpidos
son removidos tratando el tejido con boro hidratado de
sodio antes de ser teido.
Los resultados son DNA (Cromatina nuclear,
cromosomas ) teidos color fucsia y fondo incoloro, en
el caso de que se utilice una coloracin de contraste
como el Fast Green el fondo seria verde.



TECNICA
Realizar secciones en parafina o por congelacin
de 5 a 7 micras. Simultneamente se correr un
corte control (lamina blanca).

REACTIVOS:
- Solucin de Acido clorhdrico
- Reactivo de Schiff
- Agua sulfurosa
- Solucin de Verde luz al 1%.

PROCEDIMIENTO
Desparafinar e hidratar hasta agua destilada, los
cortes por congelacin se fijaran y llevaran
tambin hasta agua destilada.

Colocar los cortes en el acido clorhdrico a 60 C ,
para realizar el paso de hidrolisis. El tiempo de
permanencia en el Acido depender del fijador
que se haya utilizado:


FIJADOR TIEMPO
CARNOY 8 MIN
FLEMING 16 MIN
SUSA 18 MIN
ETANOL 5 MIN
GENDRE 5 MIN
HELLY 8 MIN
REGAUD 14 MIN
ZENKER 5 MIN
FORMOL 8 MIN
Lavar en agua destilada varios cambios.
Colocar en el reactivo de Schiff durante 20 a
30 minutos.
Lavar en agua sulfurosa o agua destilada
varios cambios.
Lavar en agua corriente.
Colorear con verde luz durante 30 segundos
Deshidratar, aclarar y montar.
RESULTADOS
ADN: Color rojo purpura
CITOPLASMA: Color verde
Mx. Hgado
Tec. Feulgen y fast green 40x
(a) Nuclolo

FEULGEN


METODO: VERDE METILO PIRONINA
Este mtodo histoqumica tiene su origen en
los mtodos empricos de tincin ms
antiguos. Fue introducida por Pappenheim a
fines del siglo ante pasado.
OBJETIVO: Permite demostrar los DNA y RNA
en el mismo corte. Con esta tcnica dos
colorantes catinicos son aplicados
simultneamente bajo condiciones
cuidadosamente controladas de
concentracin y pH.
FUNDAMENTO
Se basa en la idetificacion de cidos nucleicos tanto
del ADN como del ARN a partir del reconocimiento
del grupo fosfato, esta tcnica utiliza dos colorantes
catinicos (+) aplicados simultneamente bajo
condiciones, cuidadosamente controladas, de
concentracin y pH, en un rango de 4,0 a 4,6 siendo
4,0 el medio mas optimo para la mayora de los
materiales. Se basa fundamentalmente en la forma y
tamao de las molculas del colorante que
determinan cual ser el color impartido a cada uno
de los cidos nucleicos.
La amplia configuracin en hlice del catin del
Verde de metilo le otorga un mayor carcter
catinico por lo que es atrado electrostticamente
a los grupos fosfato en el lado externo de la cadena
de ADN y es mantenida en esta posicin por ayuda
de las uniones no aninicas a las pentosas del ADN
y las nucleoprotenas asociadas, demostrando que
posee una mayor afinidad por molculas
polimerizadas, favoreciendo por una alta
esteoespecificidad por parte de la molcula
decolorante hacia las molculas de la cadena de
ADN.
La PIRONINA Y posee un leve carcter catinico, una
afinidad a zonas menos polimerizadas y a una
estructura plana que se intercala entre los pares de
bases de los cidos nucleicos y no logra entrar al
DNA por que sus uniones son excluidos por el verde
de metilo en el lado externo de la cadena, por lo
que, se une al ARN que al ser una estructura mas
abierta admite fcilmente los cationes de la pironina
los cuales intercalan firmemente entre los pares de
bases, neutralizan los fosfatos y excluyen al verde de
metilo que no se puede intercalar.


FIJACION
El fijador de CARNOY se obtiene mejores
resultados, pero se pueden utilizar los
fijadores habituales como el formol.


TECNICA
Realizar cortes en parafina o por congelacin de
5 a 7 micras, simultneamente se correr
laminas control (testigo).
Solucin concentrada de verde metil pironina.
Verde metil
Pironina
Agua destilada
Cloroformo.
PROCEDIMIENTO
Desparafinar e hidratar hasta agua destilada.
Colorear con la solucin diluida de verde metil
pironina durante 10 minutos o 24 horas.
Retirar el exceso de colorante con papel filtro.
Deshidratar rpidamente en acetona absoluta.
Pasar a una mezcla de acetona xilol 1:1
Pasar una mezcla de acetona xilol 1:10
Aclarar en xilol y montar.
RESULTADO
ACIDO DESOXIRRIBONUCLEICO: Verde
ACIDO RIBONUCLEICO: Rojo a rosado



UTILIDAD: Est tcnica se ha usado
especialmente para la tincin histolgica de
sistema nervioso y tejido linfoide, y se ha
utilizado para contra teir con fluorocromos o
incluso con procedimientos IHQ.


GRACIAS