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Apoptose no fgado durante a

malria: papel do estresse oxidativo


e implicaes da via mitocondrial

Integrantes

Bruno Bignardi
Carlo Filho
Igor Durant
Mikael Valle
Pedro Garcia
Rodolfo Zacarias

Objetivos
Detectar se a infeco por malria pode
levar a estresse oxidativo e apoptose no
fgado de camundongos infectados com
Plasmodium yoelii.

Introduo
Todo ano 300 500 milhes de pessoas so
infectadas pela malria.
1 3 milhes morrem por ano.
Pode provocar disfuno heptica, como
necrose de hepatcito, colestase, estase da
bile, leso granulomatosa, ndulos malricos e
apoptose de hepatcitos.

Ciclo da Malria

ALBERTS, Bruce et al. Biologia molecular da clula. 5. ed. Porto Alegre: Artmed, 2010.

Apoptose: Via Intrnseca


(Mitocondrial)

Protenas anti-apoptticas (Bcl-2, BclxL)

Protenas pr-apoptticas (Bax, Bad, Bid)

Abertura dos Poros de transio da permeabilidade


mitocondrial
Liberao de protenas indutoras de apoptose
(Citocromo c, Fator de induo apopttico).

Apoptose: Via Intrnseca


(Mitocondrial)

Guha M et al. FASEB J 2006;20:1224-1226

MATERIAIS
E
MTODOS

Crescimento in vivo do P. yoelii


Guia do comit do instituto tico animal
Camundongos albinos suos (20 25g) foram
inoculados com P. yoelii (MDR)
Porcentagem de parasitemia monitorada por
preparao de esfregao sanguneo fino e
colorao Giemsa

Medida da Reduo de
GSH
Fgado de ambos os grupos
Homogeneizao
Centrifugao
Submisso do sobrenadante obtido reaes qumicas;
remoo do precipitado.
Submisso do segundo sobrenadante obtido
espectofotometria (Padro: GSH)

Medida da peroxidao
lipdica como ndice de dano
oxidativo
Fgado ambos os grupos
Homogeneizao em salina gelada
Realizao de fraes subcelulares para obteno de fraes mitocondriais
Adio substncias reagentes; aquecimento; resfriamento; centrifugao
Determinao de produtos da peroxidao lipdica como reagentes do cido
Tiobarbitrico (Padro: Tetrahidroxipropano).
OBS: Fraes da MM foram usados ao invs de todo o fgado homogeneizado
(Continha materiais reagentes do AT no-lipdico).

Medida da protena carbonila como


ndice de dano oxidativo
A carbonila foi medida como parmetro de oxidao protica.
Fgado de ambos os grupos
Homogeneizado (Tampo sdio-fosfato)
Centrifugao e precipitao de protena do sobrenadante
Exposio reagentes

Lavagem da protena
Dissoluo e centrifugao
Utilizao do sobrenadante para medir contudo da carbonila.

Anlise TUNEL para


fragmentao de DNA
Para detectar apoptose foi realizada a fragmentao de DNA
in sitio (TUNEL)
Sees fgado ambos embebidas em parafina
Desparafinizao e lavagem

Permeabilizao
Incubao

Observao dos dispositivos em microscpio ptico

Medida do potencial da
membrana mitocondrial
Mediu-se a integridade da MMI atravs da observao do
gradiente de potencial.
Isolao das mitocndrias atravs do kit de isolao
mitocondrial
Incubao (Tampo)

Registro da fluorescncia de cada amostrada (volume de


anlise 1 ml) em um espectrofluormetro

Medida in vivo de radicais hidroxila


Atravs do uso de dimetil sulfxido (DMSO) como captadores de OH, mediuse os radicais hidroxila gerados no fgado durante infeco por malria.
3 Grupos de Camundongos (6x / grupo).
Sacrifcio dos animais

Disseco do fgado
Homogeneizao 20%
Preparao em gua triplamente destilada
Processamento para extrao de c. metanosulfnico (Produto reao de OH
com DMSO).
Medida da intensidade do cromforo resultante

Efeito dos captadores dos radicais hidroxila e


spin traps em estresse oxidativo e apoptose no
fgado durante infeco por malria
Injeo de captadores especficos de OH e spin traps em
ratos 1h antes da infeco por P. yoelii (1.5 x 10 6
parasitas/rato)
Monitoramento da parasitemia; administrao diria
4 Dia (50 60% parasitemia); sacrifcio dos 3 grupos
Exciso do fgado e tratamento para a medida da gerao
de radicais hidroxila, peroxidao lipdica e apoptose

Anlise dos Dados


Clculo dos nveis de significncia
Valores menores do que 0.05 (P < 0.05)
Estatisticamente significantes.

DISCUSSO
E
RESULTADOS

A infeco por malria causa estresse


oxidativo no fgado

Guha M et al. FASEB J 2006;20:1224-1226

A infeco por Malria induz


apoptose no fgado
Fragmentao in situ
do DNA

Apoptose
Ativao da
caspase-3

Fragmentao in situ do DNA


Evidncia de fragmentao do DNA no fgado
de camundongos infectados por P. yoelii,
atravs do mtodo TUNEL.

Guha M et al. FASEB J 2006;20:1224-1226

Ativao da Caspase-3

Guha M et al. FASEB J 2006;20:1224-1226

Ativao da Caspase-3
Evidncia da presena de caspase-3 no citosol
de hepatcitos, atravs de tcnica de
imunohistoqumica.

Guha M et al. FASEB J 2006;20:1224-1226

Envolvimento da Via Mitocondrial na


Apoptose de Hepatcitos
Anlise da expresso de Bcl-2 e
Bax atravs do mtodo RT-PCR.

Guha M et al. FASEB J 2006;20:1224-1226


Guha M et al. FASEB J 2006;20:1224-1226

Envolvimento da Via Mitocondrial na


Apoptose de Hepatcitos
Estudo realizado por microscpio confocal demonstra
a translocao de Bax para a mitocndria.

Guha M et al. FASEB J 2006;20:1224-1226

Envolvimento da Via Mitocondrial na


Apoptose de Hepatcitos
Em seguida, foi estudada a alterao da
permeabilidade da membrana mitocondrial, atravs
do JC1.

Guha M et al. FASEB J 2006;20:1224-1226

Envolvimento da Via Mitocondrial na


Apoptose de Hepatcitos
A abertura dos poros de permeabilidade transitria
tem como consequncia a sada do citocromo c para
o citosol da clula.

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Envolvimento da Via do receptor de


Morte
Expresso do Fas
(CD95)

Via do Receptor
de Morte
Ativao da
Caspase-8

Envolvimento do Fas (CD95)

Guha M et al. FASEB J 2006;20:1224-1226

Guha M et al. FASEB J 2006;20:1224-1226

Ativao da Caspase-8
Todos os receptores de morte estimulam a
apoptose atravs da ativao da caspase-8;
A ativao da caspase-8 culmina na ativao
da caspase-3;
Dessa forma, detectando a atividade da
caspase-8 pode-se medir a ao de outros
receptores de morte alm do Fas.

Ativao da Caspase-8

Guha M et al. FASEB J 2006;20:1224-1226

Radical OH Causa Estresse Oxidativo e


Consequente Apoptose
Depois de revelar o estresse oxidativo durante a
malria e a induo da apoptose, foi investigado
qual o membro particular da famlia ROS
responsvel pelos resultados observados

Guha M et al. FASEB J 2006;20:1224-1226

Radical OH Causa Estresse Oxidativo e


Consequente Apoptose

Dessa forma, foi observado que a gerao de OH


pode ser a gerao do estresse oxidativo. Para
investigar o possvel papel do OH na apoptose os
efeitos dos limpadores de OH foram estudados na
ativao da caspase-3 durante a infeco.

Guha M et al. FASEB J 2006;20:1224-1226

Radical OH Como Ativador da Via


Mitocondrial

Guha M et al. FASEB J 2006;20:1224-1226

Teoria Sobre o Mecanismo


No estgio Exoeritroctico, no h apoptose.
No estgio Intraeritroctico (sanguneo), h
liberao de metablitos que podem gerar
estresse oxidativo
Protelise da Hemoglobina, gerando grupos
heme livres (redox active free heme)

Teoria Sobre o Mecanismo


O grupo heme, quando livre, txico e pode
gerar ROS (Reactive Oxygen Species)
O parasita metaboliza grupos heme livres,
formando hemozona, um polmero de grupos
heme livres que menos txico.

No obstante, uma grande quantidade de grupos


heme livres so encontrados na infeco por
malria.

Teoria Sobre o Mecanismo


Mesmo a hemozona possui ao pr-oxidante
Portanto, tanto grupos heme livres como
hemozona podem levar a estresse oxidativo
Mamferos possuem vias prprias para
metabolizao dos grupos heme livres
Durante o processo h uma grande quantidade de
Fe livre, o que gera uma grande quantidade de ROS

Concluso
Na malria:

Diminuio de antioxidantes.
Aumento de ROS (Reactive Oxygen Species) e OH.
Aumento do Estresse Oxidativo.

Induo da apoptose de hepatcitos pela via


intrnseca.

REFERNCIAS
Centers for Disease Control and Prevention, disponvel em:
<http://www.cdc.gov/malaria/about/biology/mosquitoes/freeborni_large.html>, acesso em:
20/09/2014
Guha M et al. FASEB J 2006;20:1224-1226