MICROBIOLOGA INDUSTRIAL

Claudia Cristina Ortiz Lpez

ortizc@uis.edu.co

TEMA 3: BIOPROCESOS

Principales etapas de un proceso

biotecnolgico industrial:

Seleccin/
optimizacin del
agente biolgico

Fermentacin:
produccin del
compuesto de
inters

Separacin o
recuperacin
Purificacin

Propagacin
de los
cultivos

Esterilizacin
Preparacin
de medios

Terminado

Tratamiento
de efluentes

Seleccin/ optimizacin del agente

biolgico
Factores a tener en cuenta:
Capacidad productora tan alta como sea posible
Capacidad de utilizar materias primas de bajo costo
(de produccin local)
Estabilidad del agente biolgico: para obtener
procesos reproducibles
Que no sea patgeno
Estos factores pueden incorporarse a un agente
biolgico mediante el uso de ingeniera gentica
3

Produccin del compuesto de inters

Se lleva a cabo en bioreactores o fermentadores
Son recipientes que proveen las condiciones

ambientales propicias (Temp., pH, aireacin, etc. )

para que los agentes biolgicos puedan crecer y
producir las mximas cantidades del compuesto
deseado.
4

Fermentador tipo tanque agitado

A- Inyeccin de aire
B- Difusor
C- Eje transmisor
D- Motor
E- Agitadores

F- Controladores
G- Salida gases
H- Entrada
I- Deflectores
J- Rompe-espuma
K- Camisa
L- Salida

1)Propagacin de cultivos: comienza en un tubo

de ensayo o un tubo congelado o liofilizado
donde se conserva la cepa de inters, o de una
colonia del
microorganismo previamente
seleccionado. Se propaga en el laboratorio
progresivamente aumentando el volumen del
medio de cultivo.

2) Fermentacin: Se prepara
nutrientes y se esteriliza.

el

medio

de

Se siembra un tanque de inculos cuyo volumen

depende de la escala industrial.
Vinculos

~50-1000 L y

Vfermentador industrial ~10-1000 m3

3. Separacin y purificacin:
operaciones mecnicas de ruptura de clulas.
separacin de insolubles por filtracin, centrifugacin o
sedimentacin.

separaciones primarias
adsorcin, ultrafiltracin.

por

extraccin,

absorcin,

purificacin por extraccin lquido-lquido, extraccin en

dos fases acuosas o cromatografa de afinidad.
aislamiento y acondicionamiento del producto.

4) Tratamiento de efluentes: no tiene relacin

directa con el producto pero es una etapa
imprescindible por los volmenes involucrados y
para preservar el medio.

1. Preparacin y propagacin de inculos

I. Preservacin del inculo
II. Multiplicacin del inculo

III. Cultivo de prefermentacin

IV. Fermentacin de produccin

El tamao del inculo generalmente es del orden

del 1-10% del volumen total del medio

Preservacin del inculo

El objetivo de la preservacin es mantener las

cepas durante tanto tiempo como sea posible
sin divisin celular. Se verifica pureza y
capacidad de formar producto.

Multiplicacin del inculo

El cultivo preservado se reactiva inicialmente
mediante crecimiento en un cultivo lquido en
agitacin o en medio slido si se requiere la
formacin de esporas.

Cultivo de pre-fermentacin
En general se requieren las siguientes concentraciones
de inculo:
Actinomicetos...............5 - 10 %
Otras Bacterias.............0,1 - 3,0 %
Hongos..........................5 - 10 %

Preparacin y propagacin de inculos

IV. Fermentacin de produccin

preservacin

reactivacin

Medio lquido

Medio

enriquecido

de experimentacin

CINTICA DE PROCESOS BIOQUMICOS

Los bioprocesos tienen una funcin PRODUCTIVA que cumple un rol y tiene
asociado el factor COSTO que debe ser el menor posible
MATERIA PRIMA

Acondicionamiento

PROCESO

Transformacin

Recuperacin

Celulares

Bioqumicas

(microorganismos, clulas
vegetales y animales)

(enzimas)

Libres

Inmovilizadas

Libres

PRODUCTO

Inmovilizadas

CINTICA DE PROCESOS BIOQUMICOS

VELOCIDAD DE CAMBIO: CINTICA DE CAMBIO, que
obedece al mecanismo propio del sistema.
Es propia del sistema y depende de muchos factores
que se deben conocer para tener control del proceso.
El seguimiento del crecimiento del microorganismo o
de la produccin de sus metabolitos en trminos
cinticos, se puede expresar mediante

La cintica permite modelar el fenmeno en

trminos de la velocidad e identificar los
parmetros y cmo son afectados

MODELOS MATEMTICOS

CINTICA DE PROCESOS BIOQUMICOS

Aspectos cinticos
Diseo
(dimensionamiento de equipos)
Balances de masa

Rendimiento

CINTICA DE CRECIMIENTO MICROBIANO

Crecimiento: aumento ordenado de todos los
componentes qumicos de un sistema biolgico
Depende de:
Microorganismo
Caractersticas genticas

Condiciones ambientales

CINTICA DE CRECIMIENTO MICROBIANO

BACTERIAS: FISIN BINARIA

HONGO (MOHO)
Crecimiento
apical

LEVADURA: GEMACIN

Determinacin de la concentracin msica

de clulas:
Mtodos directos (en ausencia de otros slidos en
suspensin)

Mtodos indirectos: se basan en un efecto que

inducen, como puede ser la velocidad de consumo
de un sustrato o de formacin de un producto.

Manejo cuantitativo de los microorganismos

Peso seco
Biomasa
Mediciones directas

Turbidimetra
Recuento en celda
Nmero
Recuento en placa (viables)
Consumo de nutriente

Mediciones indirectas

Acumulacin de producto

Compuesto celular

Mtodos para la cuantificacin del crecimiento de

poblaciones microbianas
Mtodo

Fundamento

Observaciones

Recuento de celda

Conteo directo de clulas

Requiere clulas individuales y medio limpio

Recuento de placa

Conteo de nmero de colonias

Supone clulas individuales. Viables

Nefelometra

Dispersin de luz

Requiere cultivo homogneo y traslcido

NMP

Estadstico

Requiere clulas individuales y medio limpio

Peso seco

Medicin directa

No admite componentes insolubles en el medio,

dispendioso

Turbidimetra

Transmisin de luz

Requiere clulas individuales y medio limpio

Volumen empacado

Centrifugacin del cultivo

No admite presencia de slidos

Fsicos y qumicos

Variado, indirecto

Cambios de viscosidad, pH, anlisis de un componente

celular

Balance de masa

Conservacin de masa

Requiere varios anlisis

Instrumentales

Variado

Requiere variados anlisis. Utilizados solos o en conjunto

con balance de masa en desarrollo

CINTICA DE CRECIMIENTO MICROBIANO

Cintica de crecimiento de un cultivo por lote batch
Etapas:
1) latencia o
induccin
3

2) crecimiento
exponencial

3) dedesaceleracin

4) estacionario
5) muerte o
declinacin
Celular

tiempo
6) Crecimiento
crptico

CINTICA DE CRECIMIENTO MICROBIANO

Fase Lag, de latencia o de induccin.
Es la expresin de un perodo de adaptacin para iniciar el crecimiento.
Su presencia y su extensin depende de:
Estado fisiolgico
Fase de crecimiento
Tamao
Tipo de microorganismos
Inculo

Composicin del medio en el que se inocula

Condiciones fisicoqumicas del medio

Fase Lag aparente: con inculos pequeos

CINTICA DE CRECIMIENTO MICROBIANO

Fase Lag, de latencia o de induccin

Cintica
(dX/dt) = 0
X = Concentracin de clulas
X = X0
t = Tiempo

X0 = Biomasa inicial
Incidencia Industrial

Costo del tiempo de fermentacin

Tamao del fermentador
Riesgo de contaminacin

CINTICA DE CRECIMIENTO MICROBIANO

Fase de crecimiento exponencial (aceleracin)

Clulas en plena reproduccin a una velocidad que es la mxima
(dX/dt) = X

MODELO DE CRECIMIENTO CELULAR

La es constante durante la fase de crecimiento exponencial y

corresponde con la pendiente en un grfico semilogartmico (figura)

dx

dt

d ln x
dt

Integrando:

ln

x
xo

=t
= velocidad Especfica de crecimiento

X= concentracin de biomasa

X= Xo e (t)

t: tiempo

X= Xo e (t)

Relacin con el tiempo de duplicacin:

To = 0

T=Td

X = Xo

X= 2Xo

Ln ( 2Xo / Xo )

Despejando Td:

. Td

O
O
O
O O
O O
OOOO OOOO

32

64

Td =

128

2X
o
ln
Xo

256

ln2
=

512

1024

To= 0
T=td
X= Xo
X= 2Xo

Td= 0.693

CINTICA DE CRECIMIENTO MICROBIANO

*El tiempo de duplicacin
es el perodo que requieren las clulas de una poblacin
microbiana para crecer, dividirse y dar lugar a dos nuevas
clulas por cada una de las que existan anteriormente.

Td aproximados (h):
Bacterias: 0.3 2.5
Levaduras: 1 - 4
Hongos: 1.5 - 7
Protozoos: 6 h.
Microalgas: 18-35
Cl. Mamferas: 20-40

CINTICA DE CRECIMIENTO MICROBIANO

Fase exponencial
El cultivo est en estado autocataltico
Es un perodo relativamente corto
Se cumple que:
X = X0 * 2n

Cintica de crecimiento
Se caracteriza por ser una fase de crecimiento constante
(dX/dt) = X
X = Biomasa microbiana
= Constante especifica del crecimiento microbiano en hr-1.
t = Tiempo en hrs

Cintica de crecimiento

Crecimiento diuxico

CINTICA DE CRECIMIENTO MICROBIANO

Fase Estacionaria (de declinacin o retardo)

Representa el fin del perodo exponencial. Se
detiene el crecimiento

La concentracin celular no cambia

Esta dado por:

Agotamiento de un sustrato
Acumulacin de un inhibidor
Otras causas ajenas al crecimiento

CINTICA DE CRECIMIENTO MICROBIANO

Fase de crecimiento crptico

En algunos cultivos es posible
apreciar una zona de crecimiento
lento despus de la fase de muerte. El
contenido citoplasmtico liberado
por las clulas lisadas proporciona los
nutrientes
requeridos
para
el
crecimiento

CINTICA DE CRECIMIENTO MICROBIANO

*Constante especfica de la velocidad
de crecimiento microbiano.
La constante especfica de la velocidad de crecimiento
microbiano () se utiliza para caracterizar el
comportamiento de una poblacin microbiana.
Su valor depende de las condiciones ambientales en
que se encuentra el microorganismo.
Existe una gran dependencia de la fuente de carbono y
energa tanto en calidad como en cantidad.

Velocidad especfica de crecimiento, h-1

dX
=

dt

Cintica de primer orden

CINTICA DE CRECIMIENTO MICROBIANO

Crecimiento de tipo exponencial que se puede modelar

lnX
1

dX

=
X

dt

dlnX
=

max

dt

Velocidades de crecimiento de algunos

microorganismos bajo condiciones ptimas

Efecto de la fuente de carbono sobre el crecimiento

Diseo de medio de cultivo

Productos gaseosos
De salida:
CO2, CH4, etc.

Inculo

Nutrientes: H20, C,
N, sales
inorgnicas,
vitaminas, otros

O2

Otros productos:
Biomasa, otros

Estequiometra del crecimiento celular y

produccin
Fuente C + Fuente de N + Fuente de O2 + sales minerales
+ nutrientes especficos
Masa celular + producto + CO2 + H2O

OBJETIVO: Desarrollo de una fermentacin con mnimo

costo por unidad de producto

Concepto de fermentacin
Proceso de fermentacin:
MICROORGANISMOS
Bacterias, levaduras , hongos

MEDIO DE CULTIVO

CONDICIONES AMBIENTALES

MICROORGANISMO

CO2

PRODUCTO
Intra o extra celular

Crecimiento microbiano: Descripcin

qumica
ACaHbOc + BO2 + DNH3

MCaHbOc Nd+ PCO2

+ QH2O C

donde: A, B, D, P y Q son moles.

CaHbOc fuente carbono-energa.
M son moles de una unidad celular, CaHbOc Nd
Aproximadamente el 92 % en promedio de biomasa
corresponde a los elementos mayores

Datos de composicin celular

Bacterias

C0.53 ; N0.12 ; O0.19 ; H0.07

Levaduras

C0.47 ; N0.075 ; O0.31 ; H0.065

Requerimientos nutricionales
FUENTE DE ENERGA:

-C: AUTOTROFO, HETEROTROFOS

-FOTOTROFICO
-QUIMIOTROFICO
FUENTE DE ELEMENTOS MAYORES: C, H, O, N
FUENTE DE ELEMENTOS MENORES: P, K, S, Mg, Ca, Na
FUENTE DE ELEMENTOS TRAZA:

Mn, Fe, Co, Cu, Zn, B, Al, Si, Cl, V, Cr, Ni, As, Se, Mo, Sn,
Nutrientes esenciales: factores de crecimiento

Clasificacin

Fuente de carbono

Fuente de energa

Auttrofos

CO2

-------

Hetertrofos

--------

Quimitrofos

Compuestos
orgnicos
---------

Quimiolittrofos

_______

Quimiorgantrofos

_______

Quimioauttrofos

CO2

Compuestos qumicos
inorgnicos
Compuestos qumicos
orgnicos
Compuestos qumicos

Fottrofos

_______

Luz

Fotoauttrofos

CO2

Luz

Fotohetertrofos

Compuestos
orgnicos
Compuestos
orgnicos

Luz

Quimiohetertrofos

Compuestos qumicos

Compuestos qumicos

Tipos de medio de cultivo

MEDIOS COMPLEJOS: Para un determinado elemento

est presente ms de una fuente. Composicin variable.

Ej.
Extracto de levadura, extracto de carne, melaza,
subproductos o desechos.
MEDIOS DEFINIDOS: Una fuente definida para cada
elemento. Compuestos puros, Composicin conocida y
reproducible, una fuente por cada elemento.
MEDIO MNIMO: fuente de C y E + sales inorgnicas
MEDIO MNIMO ENRIQUECIDO: con algn factor de
crecimiento (esencial o inductor).

Tipos de medio de cultivo

MEDIOS COMPLEJOS INDUSTRIALES

Componente

Origen

Melaza

Industria azucarera

Licor de maceracin
de maz

Subproducto del procesamiento de maz

Licor de sulfito

Desecho de la industria de pulpa y papel

Permeado de suero

Subproducto del procesamiento del suero de leche

Vinazas

Subproducto de la produccin de etanol por

fermentacin

Harinas de soya y
pescado

Industrializacin de soya y pescado

Hidrolizado y
extracto de levadura

Industria productora de levadura forrajera y de

panificacin

Criterios utilizados en la formulacin del medio(I)

CARACTERSTICAS DE LOS MEDIOS DE CULTIVO:
Contener los elementos para la sntesis celular y para la

formacin de producto
Medio ambiente favorable para el crecimiento y/o
formacin del producto.
Econmicamente rentable.
Mxima produccin.
Adaptacin constante al proceso de fermentacin.

Criterios utilizados en la formulacin del medio.(II)

Recuperacin del producto.
Eliminacin de la represin catablica.
Materiales de fcil disposicin en cantidad suficiente.

Bajos costes de transporte.

Impedir que las impurezas dificulten la recuperacin de

producto.

Diseo del medio de cultivo

Cunta biomasa vamos a generar?

Composicin celular
Fuente de cada elemento
Rendimientos

A. RANGO DE CONCENTRACIN DE BIOMASA

Matraces

0,5 - 2 g/l
Fermentador de laboratorio 1-10 g/l
Fermentador industrial
10-50 g/l
Alta densidad
120-250 g/l

b. Composicin celular
Compuesto

Bacteria
(% base seca)
Promedio

Carbono
Nitrgeno
Protenas
Carbohidratos
Lpidos
Acidos nucleicos
Cenizas

48
12.5
55
9
7
23
6

Levaduras
(% base seca)
Promedio

46-52
10-14
50-60
6-15
5-10
15-25
4-10

48
7.5
40
38
8
8
6

Hongos
(% base seca)
Promedio

46-52
6-8.5
35-45
30-45
5-10
5-10
4-10

48
6
32
49
8
5
6

45-55
4-7
25-40
40-55
5-10
2-8
4-10

Composicin tpica de compuestos

orgnicos e inorgnicos de m.o.
Constituyentes inorgnicos

Elemento
Fsforo
Azufre
Potasio
Magnesio
Sodio
Calcio
Fierro
Cobre
Manganeso
Molibdeno
Total Cenizas

Bacteria
2-3
0.2-1.0
1-4.5
0.1-0.5
0.5-1
0.01-1.1
0.02-0.2
0.01-0.02
0.001-0.01
-------7-12

g/100 g en peso seco

Hongos
Levaduras
0.4-4.5
0.8-2.6
0.1-0.5
0.01-0.24
0.2-2.5
1-4
0.1-0.3
0.1-0.5
0.02-0.5
0.01-0.1
0.1-1.4
0.1-0.3
0.1-0.2
0.01-0.5
--------0.002-0.01
--------0.0005-0.007
--------0.0001-0.0002
2-8
5-10

Sustratos

Clulas
X

S1

Productos

S2

P1
Sn

P2

Pn

 Producto:
Compuesto qumico diferente de material celular
que es liberado al medio.
Sustrato:
Compuestos que son consumidos a partir del medio
como resultado de crecimiento celular o formacin
de producto.

Factores que limitan la formulacin de medios de

cultivo:
Algunos elementos del sustrato liberados como

productos no asimilados a material celular.

Velocidades limitantes y estequiometra, deben
considerarse los rendimientos.
Nutrientes especficos que pudieran ser limitantes, o
productos especficos que pueden ser inhibitorios.
Factores ambientales.
Factores de crecimiento.

c. Fuente de cada elemento

MEDIOS INDUSTRIALES
-Fuentes de C y E
Almidn de maz, glucosa de maz, melaza, aceites vegetales, suero

-Fuentes de N
Licor de maceracin de maz, harina de soya, amonio (gas), Urea,
extracto de levadura.
-Suplementos
Sales minerales, vitaminas, aminocidos

 MEDIOS DEFINIDOS
Fuente de Nitrgeno: (NH4)2SO4
Fuente de K y P: K2PO3
Sulfatos
Cloruros
En un medio definido podemos elegir el sustrato LIMITANTE
Todos los dems elementos (nutrientes) irn en exceso entre
el 30 y el 50 %

Zabriskie, D. W., Armiger, W. B., Philips, D. H. & Albano, P. A. (1980) Traders' Guide to
Fermentation Media Formulation.

D. Rendimiento biomasa sustrato (YX/S)

YX/S
YX/S

X Biomasa producida (X X )
= s =Sustrato consumido (S S )

Xf-Xo
So-Sf

So =

X - Xo
YX/S

Se puede calcular:
Experimentalmente
Tericamente

Estimacin terica del Yx/s

Ei

% Ei en la clula
Y x/S

% Ei en la clula

Ei
% Ei en el nutriente

Y x/S

% Ei en el nutriente

% Ei en el nutriente

Para el caso de la fuente de

C y E,
Una parte del C es
excretado como
CO2
*

% Ei en la clula
F= 0.6 crecimiento aerbico
F= 0.1 crecimiento anaerbico

Para otros elementos

F= 1

Elemento Ei

Ei

%Ei en clula

12

48

glucosa

40

14

7.5

(NH4)2SO4

21.2

31

1.7

kH2PO4

22.8

39

2.5

K2HPO4

28.7

Mg

24

0.3

MgSO4.7H2O

9.7

32

0.13

(NH4)2SO4

24.2

Fe

56

0.26

FeSO4.7H2O

20

Ca

40

0.20

CaCl2

36.2

Na

23

0.06

NaCl

39.3

Zn

65

0.02

ZnSO4.7H2O

22.8

Mn

55

0.004

MnCl2.6H2O

27.7

Mo

99

0.0002

MoO3

66.6

Co

59

0.003

CoCl2.6H2O

24.8

otros

<0.01

Nutriente

% Ei en el
nutriente

Ejemplo medio para X= 6 g/l de biomasa

Nutriente

Y X/S

Concentracin g/l

glucosa

0.5

18

(NH4)2SO4

2.8

2.14 fuente limitante

kH2PO4

13.4

0.67

MgSO4.7H2O

32

0.28

FeSO4.7H2O

77

0.12

CaCl2

181

0.05

NaCl

655

0.014

ZnSO4.7H2O

1140

0.008

MnCl2.6H2O

6925

0.0013

CoCl2.6H2O

8267

0.0011

333000

0.00003

MoO3

(P)

 Ejemplo:

Calcular la concentracin de glucosa que requiere para

producir una biomasa final de 6 g/l, en aerobiosis
Peso Glucosa:
180 g
% Ei en el nutriente: 40%
Y x/S

% Ei en el nutriente
% Ei en la clula

Y x/S

40 *
48

0.6

= 0.5

So =

X - Xo
YX/S

So =

6 g/l - 0
0.5

* 1.5

18 g/l

Productividad volumtrica
y Productividad especfica
Desde el punto de vista de un proceso industrial, el solo
rendimiento no constituye elemento de juicio
suficiente para evaluar el comportamiento de una
fermentacin.
Es necesario considerar el factor cintico
Masa de producto
Productividad volumtrica

=
Tiempo X Volumen

Masa de producto
Productividad especfica

=
Tiempo X masa de clulas

Cintica de crecimiento de la S. cereviceae y del

consumo de sustrato (glucosa) en medio definido

Responder:
1.
2.
3.

4.
5.
6.

En general, qu se genera durante la fermentacin?

Cules son los aspectos importantes para la seleccin del medio de
fermentacin?
Qu es el sustrato limitante?
Por qu el rendimiento de Carbono en biomasa es menor para la levadura en
anaerobiosis que en aerobiosis (0.12 y 0.56 g/g, respectivamente)?
Por qu la melaza puede resultar un medio adecuado para fermentacin. En
qu caso se ha utilizado a nivel industrial?
En qu consiste la reaccin de Maillard y cmo afecta el medio de cultivo
para la fermentacin?