UNIVERSIDAD AUTNOMA DE

CHIHUAHUA
FACULTAD DE CIENCIAS QUMICAS

EXTRACCIN DE
DNA PLASMDICO
Titular : Dr. Quintn Rascn
Presenta: QBP Silvia Ivonne Arzola Rodrguez
Chihuahua, Chihuahua a 12 de febrero, 2011

NDICE
Introduccin
Materiales

mtodos
Resultados
Bibliografa

INTRODUCCIN
Clonacin

Tcnica de produccin de
copias de una regin de DNA especfica
Celular (in vivo) o Acelular (in-vitro)
Rondas de replicacin en clula anfitriona
Inserto
fragmento de DNA a clonar
Vector de clonacin
otro DNA con
secuencia y mapa de restriccin conocido,
pequeo y fcil de aislar

INSERT
O

VECTO
R

DNA
RECOMBINANT
E

INTRODUCCIN

Enzimas de restriccin fragmentan DNA

INTRODUCCIN

Vector
transporta
DNA extrao a una
clula
husped
adecuada; capacidad
de
replicacin
autnoma
Clasificacin:
1. Procedencia
2. Tipo de molcula que

se
usa
para
prepararlos
3. Tipo
de
clula
anfitriona
4. Gen de resistencia
5. Tamao de DNA que
acepta como inserto

INTRODUCCIN

Esquema general del procedimiento de

clonacin

1. Preparacin de DNA y vector

2. DNA recombinante
3. Transformacin (Incorporacin de

rDNA)
4. Propagacin celular y seleccin
5. Expresin del DNA clonado

INTRODUCCIN

1. Plsmidos - vectores;
2. Fragmentos de ADN

clonar;
3. Fragmentos de ADN se
insertan en plsmidos;
4. Se transforman clulas y
se cultivan en placas de
Petri y se seleccionan por
su
resistencia
a
un
antibitico.
5. Se forman colonias de
clones
(bacterias
idnticas) resistentes al
antibitico
y
que

INTRODUCCIN

PLSMIDOS
Molculas de DNA bicatenario circular
Pequeos (2-5 kb)
Libres en citosol en bacterias
(1 a 3000

plsmidos/clula) y en algunos eucariotes

unicelulares (crculo de 2 m levaduras)
Fcil de purificar a partir de cultivos
bacterianos
Incorpora insertos de mx. 10 kb
Replicones transmisibles

INTRODUCCIN

PLSMIDOS
DIANAS PARA
13
ENDONUCLEASAS

GEN
RESISTENCIA

DE

ORIGEN
DE
REPLICACIN

INTRODUCCIN

PLSMIDOS
Dependen

de

enzimas

del

husped
Utilizacin

de polimerasas (III
para elongacin y I para sntesis
de primers)

Direccionalidad de la replicacin

(unidireccional o bidireccional)
Terminacin
Modo de replicacin (forma de

mariposa)

MATERIALES Y
MTODOS

MATERIALES Y MTODOS

Solucin I: Solucin de lisozima

Tris HCl 25 - 50 mM (pH 8)
Glucosa 50 mM
EDTA 10 mM (pH 8)
Lisozima 100-200 ng/mL
Solucin II: Solucin de lisis
NaOH 0.2 N
SDS 1%
Solucin III: High Salt solution
147 gr. Acetato de K
26.25 mL Ac. Frmico
Agua hasta 500 mL

MATERIALES Y MTODOS

MATERIALES
Tubos Eppendorf
Micropipetas
Puntas estriles
Pipetas Pasteur
Microcentrfuga

MEDIOS DE CULTIVO
Medio lquido y/o slido LB (Luria Betani) adicionado con
antibitico de inters
MICROORGANISMOS
Bacterias de la familia Enterobacteriaceae
Plesiomonas shigelloides

MATERIALES Y MTODOS

MTODOS
BOILING . Holmes y Quigley (1981)

Incluye someter la muestra a extraer a 100 C por 15

minutos (lisis celular por calentamiento). Rosende et
al., 2006
LISIS ALCALINA. Sambrook y col. (1989)
1. Inocular 2 mL de medio LB suplementado con el
2.
3.
4.
5.

antibitico apropiado con una colonia transformada.

Incubar a 37 C con agitacin fuerte (200 r.p.m)
durante 15-20h.
Traspasar 1,5 mL de cultivo a un tubo Eppendorf y
centrifugar 1 min a 13.000 r.p.m.
Decantar el medio de cultivo, dejando el sedimento
celular lo ms seco posible.
Resuspender bien el sedimento en 200 L de Solucin
I. Mezclar con la punta de la pipeta. Incubar a

MATERIALES Y MTODOS

1. Aadir 400 L de Solucin II ( Lisis) hasta aparecer translucido

2.
3.
4.
5.

6.
7.
8.
9.

(Desnaturalizacin DNA).
Aadir 300 L de Solucin III (Neutralizacin). Mezclar por
agitacin (no en vortex)
Incubar en hielo 20-30 minutos.
Centrifugar durante 10 min a 13.000 r.p.m.
Tomar el sobrenadante (DNA plasmdico) y precipitar con 0.6
volmenes de isopropanol (conservado a -20C), mezclar
invirtiendo el tubo varias veces y dejar precipitar a -20C
durante 10 minutos.
Centrifugar 10 min a 13.000 r.p.m.
Lavar con etanol 70%
Centrifugar y decantar eliminando restos de etanol.
Resuspender en 50 L de tampn TE o agua estril durante 15
min a temperatura ambiente

lvarez-Fernndez et al., 2003 / Bravo et al., 1998

RESULTADOS Y
DISCUSIN
Se logr el aislamiento e identificacin de bandas

de inters para sus respectivos estudios. El

mtodo ms utilizado es el de lisis alcalina
(miniprep, minialcalino o rpido)
En particular, lvarez-Fernndez et al. (2003)

lograron asociar la presencia de integrones en

bacterias Gram negativas con la presencia de
plsmidos
conjugativos
que
les
confieren
resistencia a diferentes antibiticos.
Bravo et al.(1998) confirmaron que la resistencia

de las cepas aisladas de Plesiomonas shigelloides

esta asociada a la presencia de plsmidos
semejantes

RESULTADOS Y
DISCUSIN

Anlisis plasmdico; marcador de peso

molecular fago Lambda digerido con
enzima Hind III (Bravo et al., 1998)
Aislamiento de plsmido con miniprep y
digestin con enzimas de restriccin

BIBLIOGRAFA
Luque

J., Herrez . (2001). Texto Ilustrado de Biologa

Molecular e Ingeniera Gentica. Conceptos,, Tcnicas y
Aplicaciones en Ciencias de la Salud. Espaa: Elsevier.
Karp G. (2005). Biologa celular y molecular. Conceptos y
experimentos. Cuarta edicin. Colombia: Mc Graw Hill.
Freifelder D. (1988). Fundamentos de Biologa Molecular.
Espaa: Acribia.
Gua de Prcticas de Biotecnologa Microbiana. Departamento de
Microbiologa II. Facultad de Farmacia. (2010). En lnea. Internet. 11 de
febrero,
2011.
Disponible
en:
http://www.ucm.es/info/mfar/pdfs/guias/Guia_Biotec.pdf
Bravo L., De Paula O., Maestre J., Ramrez M., Garca B. (1998)
Susceptibilidad antimicrobiana y aislamiento de plsmidos en
Plesiomonas shigelloides. Revista Cubana Med Trop; 50. 3: 203206
Bimboim HC, Doly J. A rapid alkaline extraction procedure for
screening recombinant plasmid DNA. Nucleic Acids Research
1979;7. 6:1513-1523

 lvarez- Fernndez M., Rodrguez-Sousa T., Brey- Fernndez

E., Lpez- Melndez C., Pieiro L. (2003). Asociacin

entre integrones de clase 1 con resistencia a
mltiples antimicrobianos y plsmidos conjugativos
en Enterobacteriaceae. Rev Esp Quimioterapia; 16.4:
394-397