ELISA

(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay)

Prueba Inmunoadsorbente
Ligado a Enzimas
Mayela Lpez
M. Fernanda Rodrguez
Alexander Romero

ELISA

HISTORIA
1959 Yalowy Berson, precursor de los ensayos
inmunoenzimticos que fueron descritos
originalmente en 1971 por Engvall y Perlmann, y
Van Wemeny y Schuurs.
El uso de material radiactivo ha limitado el uso
del radioinmunoensayo, y a la ves a popularizadp
el empleo del inmunoensayo enzimtico (EIA), del
que hay dos tcnicas principales:
El ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas
El ensayo inmunolgico multiplicado por enzimas.

ELISA

La prueba de ELISA se basa en la reaccin

antgeno-anticuerpo, uno de los cuales debe ser
de reactividad conocida.
El color se genera por la interaccin de un
sustrato cromognico y una enzima que ha sido
acoplada al anticuerpo detector.
Si debe medirse el anticuerpo, se coloca el
antgeno en la fase slida, como una capa de
captura.
Despus de la reaccin del antgeno con el suero
del paciente, la capa de deteccin puede ser un
reactivo antiinmunoglobulina clase especfica (IgM
o IgG) para detectar respuesta de anticuerpos
clase especficos

ELISA

Los mtodos de ELISA dependiendo

de la actividad enzimtica se
dividen en dos tipos:
Competitivos
No competitivos

ELISA

ELISA COMPETITIVO:
En este mtodo, el anticuerpo de la
muestra va a competir con el conjugado
por un nmero limitado de sitios de unin
del antgeno. Habr ausencia de color en
una muestra positiva debido a que el
sustrato no encontrar a la enzima
porque el conjugado ha sido desplazado
por el anticuerpo presente en la muestra.

ELISA

ELISA NO COMPETITIVO:
Consiste en enfrentar la muestra
con el antgeno o anticuerpo que
est en la fase slida. Si una
muestra es positiva se formar el
complejo antgeno-anticuerpo y al
agregar el conjugado reaccionar
con el respectivo sustrato
desarrollando color

ELISA

Dentro de los no competitivos

tenemos:
Los directos que detectan
antgenos
Los indirectos que detectan
anticuerpos.

ELISA

1.
2.
3.
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9.
10.

Pasos generales de un ELISA

Tapizado del pocillo con el antgeno o anticuerpo
Adicin de la muestra problema con la mezcla de antgenos
o anticuerpos
Unin del antgeno o anticuerpo especfico al anticuerpo o
antgeno tapizado en el posillo.
Lavado del pocillo para eliminar el exceso de anticuerpo o
antgeno no unido
Adicin del anticuerpo secundario marcado con la enzima
Unin del anticuerpo secundario al antgeno o anticuerpo
Lavado del pocillo para eliminar el exceso de enzima no
unida
Adicin del sustrato
Unin del sustrato a la enzima
Desarrollo del color

ELISA Competitiva (1)

ELISA Competitiva (2)

ELISA Competitiva (3)

ELISA Competitiva (4)

ELISA Competitiva (5)

ELISA Competitiva (6)

ELISA Competitiva (7)

ELISA Competitiva (1)

ELISA Competitiva (9)

ELISA Competitiva (10)

Ejemplos

Dengue Virus

Es un virus de ARN de cadena simple

con un dimetro de 50 nm.
Pertenece a la familia de los Flaviviridae
Se distinguen cuatro grupos
serolgicos:
DEN-

1
DEN-2
DEN-3
DEN-4

DENGUE...

La infeccin con un serotipo no

produce inmunidad para los otros.
El Aedes aegypti constituye el principal
vector del dengue.

Dengue...

Imgenes clnicas:
Periodo

de incubacin de 1 a 2
semanas con escalofros.
Dolores de cabeza
Dolores de miembros y msculos.

Dengue...

Dengue hemorrgico:
Petequias
Fuertes

hemorragias nasales
Vmito de sangre
Melena
Hematuria
La agravacin de la enfermedad deriva
en el Sndrome de Shock.

Utilizacin de la prueba

El inmunoensayo se utiliza para la

determinacin cualitativa y
semicualitativa de anticuerpos IgG
especficos contra Dengue- Virus en
suero o plasma humano.

Principio del Ensayo

Las tiras de micropocillos (fase

slida) estn recubiertas con
antgenos especficos del DengueVirus.
Los anticuerpos presentes en la
muestra se unen a los antgenos
inmobilizados en la placa.

Principio...

El conjugado de anticuerpos IgG

anti humano con peroxidasa del
rbano, se une a los complejos
antgeno anticuerpo en muestras
positivas.
Despus de incubarse, los
complejos muestran una coloracin
azul, al incubarlos con TMB.

Principio...

Finalmente, se aade cido sulfrico

para detener la reaccin ( azul amarillo); la densidad se mide con un
lector de ELISA a 450 nm.

Procedimiento

Reparticin y Posicin de las muestras.

Se Grada la incubadora a 37+1 C.
Se pipetean 100 ul de controles y
muestras en los pocillos respectivos.
Se recubren las tiras con los
autoadhesivos.
Se incuba 1h + 5 min.
Despus de incubar, se retira el
autoadhesivo y se realiza el lavado.

Procedimiento...

Pipetea 100 ul del conjugado anti IgG.

Se incuba 30 min a temperatura ambiente.
Repetir el lavado.
Se pipetea 100 ul de sustrato de TMB.
Incuba 15 min en oscuridad a temperatura
ambiente.
Se aade la solucin de parada
Se mide la extincin de la solucin con
450/620nm por 30 min.

ETI- LKM1 y ETI mitocondrial

Permite la determiacin cualitativa

de autoanticuerpos dirigidos contra
el citocromo P450 (LKM1) y las
enzimas mitocondriales (M2A/M2C)
en suero humano.

Principio del Ensayo

Los pocillos de la microplaca se recubren

con los antgenos.
Al aadir las muestras, , el anticuerpo se
une a los pocillos recubiertos.
En estos se incub IgG conjugada con la
enzima peroxidasa del rbano contra IgG
humano.
Se aada cromgeno y se lee con el
espectrofotmetro.

MUCHAS GRACIAS!