AISLAMIENTO Y

PURIFICACIN
Enzimas se encuentran formando
parte de mezclas complejas,
usualmente en el interior de clulas
que adems poseen cientos de otras
enzimas.
Para estudiar una en particular, se
hace indispensable entonces un
proceso de purificacin.

CAROLINA VITA

MTODOS DE ESTIMACIN UNIDADES

El 1 requerimiento para aislar una enzima es

encontrar un ensayo cuantitativo de
actividad

Para decidir si es conveniente un paso de

purificacin, es necesario medir la cantidad
de enzima y la cantidad de impurezas antes
y despus de ese paso, y comparar los
resultados de varios procedimientos posibles.

Naturaleza del ensayo

Depender del tipo de reaccin que
cataliza la enzima.
Resultar conveniente la medicin de
la aparicin de un producto o la medicin
de la desaparicin de sustrato.
La actividad de una enzima depende
de condiciones tales como T, pH,
concentracin; por lo tanto es necesario
especificarlas y usar las mismas
condiciones para comparar actividades.

Eleccin del sustrato

Es muy importante:
barato
de fcil determinacin
estable
no sufrir reacciones laterales.
Es necesario usarlo en
concentracin saturante as la
velocidad es independiente de la
[sustrato] y proporcional a la
cantidad de enzima.

Unidad enzimtica
Se

define en forma particular para cada

reaccin segn sea conveniente.

Es

la cantidad de enzima que cataliza la

formacin de una determinada cantidad
de producto (o desaparicin de reactivo)
en un tiempo dado en determinadas
condiciones de reaccin.

Actividad especfica
La

pureza de la enzima se ve reflejada

en la actividad especfica (Ae)

Actividad

especfica es el cociente
de actividad enzimtica (expresada en
unidades enzimticas) y la cantidad
total de protenas.
Ae = Actividad enzimtica
Protenas totales

ANLISIS DE LOS DATOS

Para juzgar si un mtodo de
purificacin es adecuado, deben
calcularse:
recuperacin y
el grado de purificacin alcanzados.

Las unidades enzimticas totales de la

etapa inicial (100%) puede calcularse el
rendimiento de cada etapa refiriendo las
unidades totales de cada paso a las
iniciales.

Grado de purificacin, debe obtenerse

primero el valor de Ae alcanzado en cada
paso.

Si se considera la Ae inicial como unidad de

purificacin, el grado de purificacin de
cada etapa se calcula haciendo el cociente
entre la Ae de dicha etapa y la del primer
paso.

CRITERIOS DE HOMOGENEIDAD

Cuando una purificacin enzimtica ha

alcanzado la etapa donde posteriores
purificaciones o pasos no producen un
incremento en la actividad especfica,
pueden investigarse con mtodos
analticos la homogeneidad y pureza de la
preparacin obtenida.

Pueden utilizarse mtodos

cromatogrficos, electroforesis,
isoelctroenfoque
La obtencin de un nico pico proteico es
indicativo de homogeneidad, si esto ha
sido comprobado por varios mtodos.

Monitoreo del proceso de

purificacin

AE
Unidades totales en la fraccin i
Total de protenas en la fraccin i
Rendimiento
Unidades totales en la fraccin i
Unidades totales en la fraccin original
Porcentaje de purificacin
AE en la fraccin i
AE en la fraccin original