Bqca.

Maria Victoria Ivan

2012
Universidad Nacional del Nordeste
Hematologa Clnica

INTERNATIONAL ORGANIZATION FOR

STANDARDIZATION (ISO) 15189: 2007.
Laboratorios mdicos. Requerimientos
particulares para calidad y competencia

Tres fases en el proceso de evaluacin total:

Pre-analtica*: responsable del 49-73% de los errores
en el laboratorio.
Analtica: responsable del 7-13% de los errores.
Post-analtica: responsable del 13-20% de los errores.
*La fase pre-analtica comienza, en orden cronolgico, desde el
pedido mdico, e incluye la solicitud de exmenes, la
preparacin del paciente, la recoleccin de la muestra
primaria, y el transporte hacia o dentro del laboratorio y
finaliza cuando el proceso de anlisis se inicia.
2

Hawkins R, Ann Lab Med, 2012; 32:5-16

FASE PRE-ANALTICA
Limpieza del material
SOLUCION DE HIPOCLORITO DE SODIO
1% V/V uso general
2.5% V/V lavado de material de vidrio
10% V/V sangre derramada
MEZCLA SULFOCRMICA

FACTORES FISIOLGICOS

EDAD

SEXO
EMBARAZO
CICLO CIRCADIANO
CICLO MENSTRUAL
PATOLOGA DEL PACIENTE

PREPARACIN DEL
PACIENTE*

AYUNO: por lo menos 4 h.

ESTUDIO DE FIBRINOLISIS: reposo
durante 30 minutos y extraccin sin
torniquete
SUEROS TERAPUTICOS
NO FUMAR 2 H. ANTES
EVITAR EJERCICIO INTENSO
STRESS MENTAL
MEDICAMENTOS: anticonceptivos,
terapia hormonal de reemplazo

*Blombck M et al. J Thromb Haemostasis, 2007; 5:855-8.

MATERIAL DE EXTRACCIN

Tubos de plstico o vidrio

siliconado (Lote y fecha de
vto.) con tapa celeste (ISO
6710)
Agujas
Adaptador con aguja
Jeringas de material con
superficie no activante (ej.
polipropileno) de volumen 20
mL

MATERIAL DE EXTRACCIN

Cul aguja usar?

Elegir de acuerdo a:
Volumen de sangre
Edad del sujeto
Tamao de las venas del
sujeto

IDEAL: Agujas de 19-21 G (0,81,0 mm)

*Los resultados de TP y APTT no presentaron diferencias
significativas empleando agujas ms pequeas 23G o 25G, aunque
si las hubo en el recuento de plaquetas (ms bajas) y dmero D
(ms alto).
8

*Lippi G et al. Blood Coagul Fibrinolysis, 2006; 17(7): 557-61.

ANTICOAGULANTES

Recomendado (CLSI, ISTH y CAHT): Citrato

trisdico dihidratado (Na3C6H5O72H2O)
105 -109 mM (3,13-3,2%)
Aceptable: citrato trisdico dihidratado
(Na3C6H5O72H2O) 129 mM (3,8%)*
Inaceptable: oxalato, heparina, EDTA
Proporcin volumen sangre/citrato= 9/1
Corregir cuando el Hto >55% (CLSI)
<25% (CAHT).
Vol. Cit.= 1,85 x10-3 x (100-Hto) x Volsangre

*Los tiempos de coagulacin tienden a ser ms largos con citrato trisdico 3,8%

ADITIVOS

Citrato y mezcla anti-plaquetas: La mezcla

bufferada CTAD est compuesta por citrato
trisdico/cido ctrico (0,105 M), teofilina (15 mM),
adenosina (3,7 mM) y dipiridamol (0,198 M), con pH
5,32-5,38. til en el monitoreo de terapia con heparina
mediante APTT y ensayo anti-Xa. Inhibe la funcin
plaquetaria.
Citrato e inhibidor de la fibrinlisis: buffer citrato
sdico 0,45 M, pH 4,3 con un aditivo citrato
fuertemente cido. Estabiliza el plasma para el anlisis
de factores fibrinolticos.
Citrato e inhibidor de proteasas: aprotinina,
protege al plasma de la accin protesica antes
de
10
realizar las pruebas de coagulacin especiales. Con ella

VENOPUNCIN

Desaconsejado
por grupo CAHT

11

VENOPUNCIN

Aplicar las precauciones universales de bioseguridad.

Realizar la extraccin con guantes, por puncin directa no
traumtica.
Evitar la extraccin de catter (aadir al informe si se sospecha la
presencia de heparina). Se recomienda descartar los primeros 5
mL de sangre o 6 veces el volumen muerto del catter.
1er Tubo de descarte: no recomendado por CLSI. Cuando se usa no
debe tener aditivos o ser un tubo para coagulacin. Se ha
comunicado diferencia significativa en el TP/RIN entre los tubos 1 y
2 de recoleccin.*
Torniquete durante menos de 1 minuto con ligadura plana.
Una vez extrada y colocada en el tubo la sangre , mezclar por
inversin suavemente 3 a 6 veces.
Identificar el tubo con la muestra recolectada en presencia del
paciente despus de la extraccin.
12

*Tekkein N et al. Blood Coagul Fibrinolysis, 2012; 23(4): 299-303.

IDENTIFICACIN DE LA
MUESTRA

Nombre completo del paciente

Nmero de identidad nico
Fecha y hora de la extraccin
Nombre de la persona que realiz la
extraccin
Tipo de muestra: sangre entera, plasma,
anticoagulante usado, suero, etc.
Ensayo a realizar (optativo)
13

TRANSPORTE

Evitar las temperaturas extremas

No transportar las muestras en hielo: activa al
FVII, disminuye el FVW y rompe las plaquetas.
No debe transcurrir ms de 1 hora entre la
extraccin y el arribo al laboratorio
Para el monitoreo de la terapia con heparina,
la muestra se debe centrifugar dentro de 1
hora de extrada, aunque si se usa CTAD se
puede esperar hasta 4 horas.
14

CENTRIFUGACIN

Centrifugar los tubos tapados hasta obtener plasma

relativamente pobre en plaquetas (plaquetas < 10 x

109/L).
Se centrifuga a 1500 g (3000 rpm) por no menos de 15
minutos a temperatura ambiente.
Usar la doble centrifugacin hasta obtener plasma pobre
en plaquetas (plaquetas < 5 x 109/L) para pruebas
hemostticas especiales (anticoagulante lpico, terapia
con heparina). Tambin se puede filtrar el plasma para
obtener plasma libre de plaquetas (puede prolongar el
Azlin I et al. demostraron que una centrifugacin a 4000 rpm durante 5 minutos no produjo
TP y APTT).
diferencias significativas en el resultado de TP, APTT y F (Med & Health, 2011; 6(1): 68-72 ), con
respecto a la muestra centrifugada a 3850 rpm durante 15 minutos.
15

CAUSAS DE RECHAZO DE
MUESTRAS

Muestra coagulada
Muestra tomada con anticoagulante incorrecto
Relacin sangre/anticoagulante inadecuada (tubo subllenado o sobrellenado). Se debe recolectar por lo menos
el 90% del volumen.
Muestra no identificada o mal identificada
PRUEBA AFECTADA*

LLENADO DEL TUBO

APTT

89%

FIBRINGENO

78%

F VIII

67%

TP
RESISTENCIA A LA
PROTENA C ACTIVADA

<67%

Lai et al informaron un 0,57% de muestras rechazadas (Ann Lab Med, 2012;

16
32:216-9)
*Lippi G et al. Semin Thromb Hemost, 2012; 38(6): 565-75

INTERFERENCIAS

LIPEMIA: no interfieren [TG] < 700 mg/dL

ICTERICIA: no interfieren [BIL] < 15 mg/dL
HEMLISIS: no interfieren [Hb] < 100 mg/dL
HEPARINA: no interfiere en TP si es <0,5 U/mL

17

ESTABILIDAD DE LA
MUESTRA*

PRUEBA

ESTABLE

TP

24 horas en tubo cerrado

sin centrifugar a temp.
amb.

APTT en pacientes no
heparinizados

4 horas en tubo cerrado

sin centrifugar a temp.
amb.

APTT en muestras con

heparina no fraccionada

1 hora en tubo cerrado

sin centrifugar a temp.
amb. Procesar antes de
las 4 hs.

Anti-Xa,
TT, FV, prot.
C se Centrifugar
y procesar
Si las muestras
no se procesan
a tiempo
separa el plasma
y se congela a -20C (2
antes de se
lasdescongela
4 hs.
semanas) o a -70C (6 a 24 meses). Para procesarlas
rpidamente en
bao a 37C.
18
*Recomendaciones de CLSI, 2008.

19

Procesamiento de la
muestra

a.

Plasma citratado rico en plaquetas (PRP)

Centrifugar 5 min. a 900 rpm, separar el

plasma y

mantener a temperatura ambiente hasta 2 h

Funcin plaquetaria y TPR

20


b. Plasma citratado pobre en plaquetas (ppp)
Centrifugar

10

min.

3000

rpm,

plasma

relativamente pobre en plaquetas ( <10.000/

mm3). Utilizar dentro de las 4 horas para estudios
prequirrgicos y control de anticoagulacin en
pacientes

sin

antecedentes

de

sangrado

trombosis
21

c. Plasma citratado libre de plaquetas

Doble centrifugacin de 15 min. a 4500 rpm
(<5.000 pq/mm3) permite realizar todos los
estudios, se puede fraccionar y congelar junto
a un testigo normal.
Es

el

procedimiento

ideal

para

preparar

muestras que deben ser derivadas a otros

laboratorios para su estudio.

22


d. Plasma citratado libre de plaquetas
Pasar PPP por un filtro Milipore de 0.22 um de
poro, para muestras que deban guardarse a
-70C junto con un testigo normal.
Presenta el inconveniente que suele activar
las muestras.

23


e. Preparacin de pool de plasmas normales
Se extrae sangre a 10 sujetos normales con
bsico de coagulacin normal y se prepara
PPP, se fracciona y se conserva a -80C hasta
6 meses o solo 1 mes si se guarda a -20C

24


f. Preparacin de plasma adsorbido
Es plasma desprovisto

de los factores vitamina K

dependiente (II ,VII, IX y X). Se obtiene a partir de sangre

anticoagulada con oxalato de sodio 0.1M en relacin 1+9.

El PPP oxalatado se mezcla con Sulfato de Ba (50 mg por

ml de plasma). Se incuba 15 min a 37C, mezclando por
inversin peridicamente, se centrifuga y se recoge el
sobrenadante. Se controla haciendo un TP que deber ser
mayor a 60 seg.
25


g. Preparacin de suero envejecido
Aporta los factores VII, IX, X y un 50% de XI y
XII. Se obtiene dejando coagular la sangre en
tubo seco por espacio de 4 hs. Se centrifuga
15 min a 3000 rpm. Se puede mantener a 4C
por 24 horas o fraccionar y congelar.

26


h. Preparacin de plasma envejecido
Deficitario en factor V y VIII, se extrae sangre
con Oxalato de sodio 0.1 M en proporcin
ac/srge 1+9, se obtiene PPP y se lo incuba a
37C.
Cuando el TP es mayor a 60 segundos se lo
fracciona y congela.
27

REACTIVOS UTILIZADOS

Trazabilidad: Propiedad del resultado de

una medicin o del valor de un estndar,
de poder ser relacionado con
referencias establecidas, generalmente
patrones nacionales o internacionales,
a travs de una cadena ininterrumpida
de comparaciones, cada una de ellas
con sus incertidumbres establecidas.
28
Linealidad

MANTENIMIENTO Y LIMPIEZA
DE INSTRUMENTOS

Diario
Semanal
Mensual

29

PRECISIN RECOMENDADA

*Para las pruebas globales CV<5% usando

automatizacin y CV<10% para tcnicas manuales.
*Para la determinacin de factores por mtodo
coagulable CV<10% y para tcnicas amidolticas
CV<5%.
De acuerdo a la variabilidad biolgica la
imprecisin mxima tolerable para TP, APTT y F es
de 3%, 2% y 8%, respectivamente
30

*Grupo CAHT, 2003. Ricos C et al. 2012 , http://www.westgard.com/biodatabase1.htm

COEFICIENTES DE VARIACIN DE TP,

APTT Y F SEGN INSERTO Y
OBTENIDOS EN EL LABORATORIO

PRUEBA
TP
INSERTO
TP
OBTENIDO
*
APTT
INSERTO
APTT
OBTENIDO
*
F INSERTO
F
OBTENIDO
*

CONTRO
L
NORMAL
0,93%

CONTROL CONTROL
ANORMAL ANORMAL PROMEDIO
BAJO
ALTO
1,92%
1,92%
1,59%

2,5%

1,8%

0,9%

1,73%

1,68%

1,72%

3,02%

2,14%

2,6%

3,7%

3,3%

3,2%

5,89%
5,4%

8,0%
6,3%

ND
5,0%

6,94%
5,57%

31

*Instituto de Maternidad y Ginecologa Nuestra Seora de las Mercedes,

Control de Calidad
Interno (CCI)

Evala la precisin de la metodologa utilizada.

Es decir la concordancia entre medidas repetidas
de una muestra.
Se utilizan materiales de control y se observa si
los resultados obtenidos estn dentro de los limites
de variacin esperados para esas muestras.
Puntos a tener en cuenta para realizar un CCI:
-Planificar el CCI en base al requerimiento de lo que se va a evaluar
Lab. 24 h controlar cada 6 hs (TP, KPTT, TT, FI)
Gran cantidad de muestras en batch
-manual------------------ controlar c/50 muestras
32
-coagulmetros---------controlar c/100 muestras

-Seleccionar el material de control

adecuado
Pool de plasma
citratado de 20
donantes normales conservado a -80C y
Procesar
10 veces, para calcular
la media (x)
descongelado
a 37C
Pool de plasma citratado conservado a
-20C para 1 semana
y el desvo estndar (DS o S2)

33 controles
Estos sern los valores de referencia ideales para los


Plasma control liofilizado comercial:
Reconstituir con agua destilada (pH 6.8-7.2) usar luego
de los 30 min. Traen los rangos de aceptabilidad para cada
determinacin.
Incluir un control normal y otro patolgico en el rango
de inters clnico.

34

-Evaluar los resultados del control de calidad

Los resultados se evalan contra el valor ideal
previamente establecido (x) y en general se aceptan
como validos aquellos que caigan dentro de +/- 2 DS

Carta de Control de Calidad

*Reglas de Westgard

35

Coeficiente de Variacin (CV)

Es una medida de la variabilidad de los resultados, se
expresa como porcentaje y se calcula teniendo en cuenta X y SD:

CV= SD/X . 100

Los coeficientes de variacin (CV) entre dos controles

realizados en das sucesivos deben ser:
-Para las pruebas globales < 5% usando automatizacin y
< 10% para tcnicas manuales.
-Para dosaje de factores por mtodo coagulable
para tcnicas amidolticas <5%.

36

< 10% y

Control de Calidad
Externo

Evala la habilidad de un laboratorio para obtener un

resultado correcto, es decir, evala la sensibilidad de la
metodologa utilizada.
Permite compararlo con el desempeo de los pares.
Programas de Evaluacin Externa de la Calidad para
Hemostasia
Internacionales:
a- United Kindom National External Assesment Schemes (
www.ukneqas.org.uk)
bCollege of American Pathologist (www.cap.org)
Nacionales:
a- Subprograma Hemostasia del Programa de Evaluacin
Externa de la Calidad de la Federacin Bioqumica de la
37
Provincia de Buenos Aires (www.faba.org.ar)

BIBLIOGRAFA
Adcock D, Hoefner D, Kottke-Marchant K, Marlar R, Szamosi D,
Warunek D. Collection, transport and procesing of blood specimens for
testing plasma-based coagulation assays and molecular hemostasis
assays; approved guidelines- Fifth edition. Wayne, PA: Clinical and
Laboratory Standards Institute; 2008:28. CLSI Document H21-A5.
Grupo CAHT. Fundamentos para el manejo pctico en el laboratorio de
hemostasia. Buenos Aires. Primera edicin; 2003.