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ACIDOS

NUCLEICOS

MSc. CSAR ALBERTO GUZMN VIGO


cguzmanvigo@gmail.com

ACIDOS NUCLEICOS
SON POLMEROS CONSTITUDOS
POR LA UNIN MEDIANTE
ENLACES QUMICOS DE
UNIDADES MENORES LLAMADAS
NUCLETIDOS
SON COMPUESTOS DE ELEVADO
PESO MOLECULAR , ES DECIR
MACROMOLCULAS

Friedrich Miescher, trabajando en el laboratorio de Flix Hoppe-Seyler, en el Castillo


de Tbingen (Alemania), descubri en 1869 el DNA, al que llam nuclena

Me parece que va a
emerger una completa
familia de estas nuclenas
que contienen fsforo que
quiz merezca igual
consideracin que las
protenas

Acido Nuclico: polmero de nucletidos

Componentes de un nucletido:

base N + pentosa + fosfato

Azcares de los cidos nuclicos

RNA

DNA

Bases nitrogenadas de los cidos nuclicos

(RNA)

(DNA)

ENLACE b
GLUCOSDICO

Nucletidos del DNA

Rosalind Franklin

Maurice Wilkins

Modelo de Watson y Crick (1953) de la estructura del DNA

Replicacin del DNA segn Watson y Crick

El RNA: ribonucletidos

Procesamiento del rRNA (nucleolo)

Los genes eucariticos alternan secuencias


codificantes (exones) y no codificantes (intrones)

Procesamiento del htRNA eucaritico


NUCLEO

CITOPLASMA

Traduccin
Exportacin

Asociacion de un gen una funcin


Mendel: Un gen una caracterstica
Boveri, Weismann, Sutton: Los genes forman
parte de los cromosomas
Morgan, Sturtevant : Los genes tienen
localizacin especfica
Griffith, Avery, Hersey y Chase: Genes
compuestos de ADN
Watson y Crick: Estructura de DNA: Codificacin
heredable

Se define el mecanismo por medio del cual la


informacin almacenada en un gen se convierte
en el trabajo que gobierna las actividades
celulares?

Relacin entre genes y protena


Archibald Garrod (1908): enfermedades,
efecto de ausencia de enzimas especficas:
Alcaptonuria (Ausencia de enzima que oxida
el cido homogentsico)

Manchas
oscuras en la
Esclertica
(Ocronosis)

Beadle y Tatum (1940): Resucitaron la idea de que los genes controlaban la produccin
de protenas. Experimento de mutantes genticos en Neurospora.

Hiptesis un gen = una enzima,


Un gen un = polipptido

FLUJO DE LA INFORMACIN EN UNA CLULA


EUCARIOTA

TRANSCRIPCIN: Sntesis de un RNA a partir


de un DNA
TRADUCCIN: Sntesis de protenas, requiere
de ribosomas (protenas + RNA). Los RNA de un
ribosoma se conocen como RNA ribosomales,
cada uno se transcribe a partir de las cadenas
de un gen.
Los RNA ribosomales: reconocen y unen otras
molculas, proveen apoyo estructural y
catalizan las reacciones qumicas por medio de
las cuales los aminocidos se unen de manera
covalente
La traduccin tambin requiere RNAt

SINOPSIS DE LA TRANSCRIPCIN

35pb.

9pb.

15pb.

Enzimas: RNA polimerasa. El sitio de


unin en el DNA, se llama promotor,
Requieren la ayuda de factores
Transcripcionales.
La polimerasa se mueve hacia el extremo
Terminal 5. Conforme la polimerasa avanza
El DNA crece del extremo 5 en una
Direccin 3 .
Las polimerasas son capaces de incorporar
De 20 a 50 nu. por segundo

Sntesis de RNA
1. vinculacin de la polimerasa con el DNA
molde: Promotor (determina cul de las dos
cadenas del DNA se transcribe, y sitio). El
promotor para el reconocimiento necesita de
factores transcripcionales
2. Movimiento de la polimerasa hacia el
extremo 5 terminal y ensamblaje de una
cadena complementaria de RNA, por
incorporacin de nucletidos
3. la polimerasa incorpora alrededor de 20 a
50 nucletidos por segundo

Transcripcin y procesamiento del RNA en


clulas eucariotas
Las clulas eucariotas tienen tres enzimas que transcriben:
La RNA polimerasa I: Sintetiza RNA ribosomal grande (28S, 18S,
5.8S)
La RNA polimerasa II: Sintetiza RNAm y la mayora de RNA
nucleres pequeos (snRNA y snoRNA)
La RNA polimerasa III: Sintetiza RNAt, RNAr 5S y el snRNA U6
La transcripcin requiere de una variedad de protenas
accesorias o factores de transcripcin, contribuyen a la unin de
la polimerasa al DNA molde
Los tres tipos de RNA derivan de molculas precursoras de RNA,
que son mucho ms grandes que el producto final de RNA, que es
equivalente en longitud a un transcrito primario o pre-RNA
El segmento correspondiente del DNA del cual procede un
transcrito primario se conoce con el nombre de unidad de
transcripcin

Entre 73 y 92 nucletidos
Aparte de A,U,G,C, tiene bases raras:
Seudouridina(), Ribotimidina (T), mI
(metilinosina), Inosina (I), dimetilguanosina
(me2G),Dihidrouridina (D), metilguanosina
(meG.
Poseen secuencias de nucletidos en un
segmento de la molcula que son
complementarias de secuencias localizadas
en otras partes de la molcula.
A causa de secuencias complemntarias
todos los RNA tienen la posibilidad de
plegarse para formar estructura que semeja
una hoja de trebol
El aminocido siempre se fija en la adenina
en el extremo 3
Las bases raras se encuentran en las asas,
interrumpen formacin de puentes de
hidrgeno y sirven de sitio de
reconocimiento para diferentes protenas
La parte del RNAt que participa en la
interaccin con el RNAm se denomina
anticodn, localizado en el asa media de la
molcula. Dicha asa se compone
invariablemente de siete nucletidos y los
tres mediales forman el anticodn.
Los aa. se unen al RNAt por accipn de la
sintetasa de aminoacil RNAt

Los RNAt actan como adaptadores, llevan a cabo la


decodificacin de la informacin de un mRNA.
Por un lado se une a un aa. Especfico y por otro lado a un
mRNA.

SINTESIS DE PROTENAS
1.
2.

3.
4.

5.

Ocurre de modo semejante en todas


las clulas
Tres tipos de RNA desempean papel
cooperativo
RNAm Transportador de la
informacin
RNA Asociado a protenas forma el
ribosoma
RNAt portadores de aminocidos
lectores del mensaje
El orden de los aminocidos en la
cadena proteica (secuencia) esta
determinada por
El orden de los aminocidos en la
cadena proteica (secuencia)
determina la funcin de la nueva
protena
Es necesario un cdigo bilinge para
pasar la informacin de la secuencia
de bases a aminocidos

Mtodos de
identificacin

ELECTROFORESIS EN GELES

La electroforesis en Geles es una tcnica ampliamente


utilizada para el anlisis de protenas y cidos
nucleicos. La electroforesis en gel de Agarosa es
rutinariamente utilizada para el anlisis del AND
La agarosa es extrada de las algas, polisacrido lineal
(con peso molecular ~12 000 Da), es una repeticin de
la unidad bsica, la agarobiosa, que comprende
unidades alternadas de galactosa y 3,6anhidrogalactosa.
La electroforesis en gel es un procedimiento que
separa las molculas sobre la base de su velocidad de
movimiento bajo la influencia de un campo elctrico.

DNA es una molcula cargada negativemente.


Cuando es colocado el DNA en un campo elctrico,
migra hacia el polo positivo.
Un gel de agarosa es utilizado para determinar el
movimiento del DNA y separado por tamaos.
H

O2

DNA

Fuente de
poder

La agarosa polimerizada es porosa,


permitiendo el movimiento del ADN
Scanning Electron

Micrograph of Agarose

Qu rpido puede migrar el ADN?

ntensidad del campo elctrico, buffer, densidad del gel de agaro


Intensidad
Size of the DNA!
*DNA pequeo se mueve ms rpido que el DNA gran tamao
La electroforesis en gel separa el ADN de acuerdo a su tamao
DNA

small
large

Fuente de
poder

Dentro del gel de agarosa, el AND migra


inversamente proporcional al log10 de su

ELECTROFORESIS EN GELES
Fuente de poder

Buffer de corrida:

Buffer de carga:

Equipo de Electroforesis
Fuente de poder

Tapa

Tanque para el gel

Cables elctricos

Bandeja
Peines para el gel

Colocacin del gen el la cmara de electroforesis

El buffer de electroforesis cubre el gel hasta una profundidad


de lo menos 1 mm.

DNA

buffer

Lugar de inicio

Ctodo
(negativo)

nodo
(positivo)

Cuidadosamente se coloca la puntera de la pipeta sobre pozo


(hueco) y poco a poco expulsar la muestra. La muestra deber
hundirse dentro del pozo. Tener cuidado de no perforar el gel con
la puntera.

DNA Ladder Standard


12,000 bp
5,000

Migracin
del ADN
Nota: El azul de
bromofenol migra
aproximadamente a la
misma velocidad que
una molcula de ADN
de 300 pb.

Azul de bromofenol
+

2,000
1,650
1,000
850
650
500
400
300
200
100

Tcnicas BLOTTING

Blotting technique
Professor Sir Edwin Southern

Southern Blot

Northern Blot

Western blot

It is used to detect DNA.

It is used to detect RNA.

It is used to detect protein.

Southern Blotting

Capillary plotting apparatus

Southern Blotting: Pasos


1. Digestin del ADN con una
apropiada enzima de
restriccin

2. La mezcla compleja de
fragmentos es colocado el
gel de electroforesis para
la separacin de
fragmentos de acuerdo a
su tamao.

Southern Blotting: Pasos


3. Los fragmentos de restriccin
presentes en el gel son
denaturados con alcal y
tansferidos a
4. a una membrana de
nitrocelulosa (filtro) o
membrana de nylon para
blotting.

Este procedimiento preserva la distribucin de los fragmentos


en el gel, creando una replica del gel sobre el filtro.

Southern Blotting: pasos


5. El filtro es incubado bajo condiciones de hibridizacin con
una sonda especfica radioisotpica (radiolabeled DNA

probe).
La sonda hibridiza al fragmento de restriccin
complementario.

6. El exceso de la sonda es lavado y la sonda que permanece


unida al filtro es detectada por autoradiografa, lo cual
revela el fragmento de ADN que se mantiene unido a la
sonda hibridizada.

Southern Blotting: Pasos

Southern Blotting

Southern Blotting

Reaccin en cadena de la polimerasa(PCR)


Procedimiento

Desnaturalizacin: Calor de 94C. Hay una


separacin fsica de las dos cadenas.
Hibridizacin: La temperatura se reduce a 54C.
Extensin: Temperatura de polimerasas 72C., los
primers tienen una fuerte atraccin al molde o
templado

Reaccin en cadena de la polimerasa(PCR)


Procedimiento

Fusin
95C

Hibridizacin
50-60C

Extensin de
La cadena
75C

2do Ciclo
95C
50 - 60C
75C

Primer Ciclo
Si repetimos el ciclo, tendremos cuatro copias
Mltiples ciclos darn un incremento exponencial en el nmero de copias

Reaccin en cadena de la polimerasa(PCR)


Procedimiento

Reaccin en cadena de la polimerasa(PCR)


Procedimiento

Reaccin en cadena de la polimerasa(PCR):


Componentes esenciales en el proceso

ADN polimerasa termoestable (

Taq ADN polimerasa:

Taq Thermus aquaticus, Pwo Pyrococcus woesei, Pfu Pyrococcus furiosus, Tli Thermococcus
littoralis)

Oligonucleotidos iniciadores (primers)


Desoxiribonucletidos trifosfatados
(dNTPs)
Cationes divalentes
Buffer (para mantener el pH)
ADN molde (Templado)