TEMA 19- ESTRATEGIAS DE CONTROL DE ACTIVIDAD

ENZIMTICA II.
1. Introduccin regulacin por Cambios Conformacionales.
2. Interaccin protena-ligando.
2.1. Funcin de Scatchard.
2.1.1. Linearizacin de la ecuacin de Scatchard.
2.2. Ecuacin de Hill.
2.2.1. Linearizacin de la ecuacin de Hill.
2.2.2. Razn de saturacin Rs.
3.Modelo Protenas alostricas.
3.1.Modelo concertado de Monod, Wyman y Changeux (MWC)
3.1.1. Enzimas alostricas tipo K
3.1.2. Enzimas alostricas tipo V
3.1.3. Modelo alostrico mixto
3.2. Modelo secuencial (KNF).

Regulacin por Cambios Conformacionales

- Observaciones experimentales
i) Observaciones experimentales que condujeron al desarrollo
de la idea sobre los cambios conformacionales y su papel en
la regulacin de la actividad enzimtica.
- Modelo de Monod-Wyman-Changeux
- Modelo de Koshland-Nemethy-Filmer
ii) Modelos tericos empleados para la descripcin de este
sistema de control.
iii) Significado biolgico/bioqumico de este tipo de control.

I) Observaciones experimentales
* Muchas de las ideas sobre el control conformacional de la actividad
enzimtica se desarrollaron como consecuencia del trabajo sobre las vas
biosintticas de los aminocidos en microorganismos, especialmente en E.
coli.

* A mediados de la dcada de los aos 50 se descubri que la Treoninadehidratasa, primera enzima de la va biosinttica de la Ile, en E. coli, se
inhiba fuertemente por Ile, producto final de la va, que tiene muy pocas
analogas estructurales con el sustrato de la enzima, la Thr.
Threonine
dehydratase

L-Thr ---------> 2-Oxo-butyric acid ---> ---> --->... ---> ---> L-Ile

- Slo la primera enzima de la va, la treonina-dehidratasa,

muestra este tipo de inhibicin.

* Un ejemplo, semejante, se encontr en el caso de la enzima

Carbamoiltransferasa o Aspartato Transcarbamilasa
(ATCasa), enzima que cataliza la primera reaccin de la va
biosinttica de las bases pirimidnicas, en E. coli, la cual se inhibe
tambin por el producto final de la va, especialmente por CTP.

Active relaxed form

COOCH2
HN-C-COOHH

COOO CH2
H2N-C- N-C-COOHH

Quaternary structure

Catalytic subunits

CCC
R
R

R
R

CCC

R
R

Regulatory subunits
Catalytic subunits

- - -

Carbamoyl aspartate

O
H2N-C-O-PO32-

Aspartate

- - -

Carbamoyl
phosphate

ATCase
ATP

CTP

CTP

Feedback
inhibition
CTP

CTP

CTP

CTP

Inactive tense form

CTP

Nucleic acid
metabolism

* En este caso, tambin se observ que el ATP poda actuar

activando a la enzima, la ATCasa; proporcionando as un
mecanismo para conseguir el balance entre la produccin de
nucletidos purnicos y pirimidnicos, necesarios para la
biosntesis de cidos nucleicos.
* A principios de los aos 60, ya se haban descrito varios
sistemas que presentaban este tipo de regulacin, en los que
nicamente la primera enzima de la va era inhibida por
retroalimentacin o feed-back.
* El primer intento serio de unificar todas estas observaciones fue
realizado por Monod, Changeux y Jacob, y constituye uno de
los trabajos clsico de la Enzimologa.
- Monod, Changeux and Jacob (1963). J. Mol. Biol. 6, 306

- En este trabajo se resaltan los siguientes puntos o

caractersticas comunes a este tipo de sistemas:
a) El ligando implicado en la regulacin de la actividad
enzimtica (molcula reguladora o efector), generalmente, es
estructuralmente diferente del sustrato o el producto de la
reaccin que cataliza la enzima retroinhibida.
b) La mayor parte de las enzimas cuya actividad se
controla/regula por este tipo de regulacin, no muestran cinticas
hiperblicas clsicas cuando se representa v [S], sino que
muestran una cintica de tipo sigmoidal.

c) Es relativamente fcil distinguir entre la unin del efector a la

enzima y la unin del sustrato. Varios tratamientos qumicos y fsicos nos
permiten desensitizar la enzima, es decir, hacerle perder su respuesta ante
las molculas reguladoras o efectores sin que ello lleve parejo la perdida de la
actividad cataltica. As en el caso de la ACTasa un tratamiento trmico, suave,
da lugar a una enzima activa no inhibible por CTP. La enzima desensitizada
muestra una cintica hiperblica semejante a la que presentan las enzimas
michaelianas.

d) Generalmente las enzimas que se regulan por este mecanismo

son oligmeros, es decir, protenas formadas por varias
subunidades iguales o distintas, unidas entre si por fuerzas
dbiles.

* Monod, Changeux y Jacob propusieron que la molcula

reguladora o efector se une a un sitio de la enzima diferente del
centro activo, de manera que la interaccin entre la molcula
reguladora y el sustrato tiene lugar de manera indirecta o
alostrica, (del griego otra estructura).
* La unin de la molcula reguladora al sitio de regulacin
induce un cambio conformacional reversible en la enzima que
causa una alteracin de la estructura del centro activo y los
consiguientes cambios en sus propiedades cinticas.

Sitio regulador
Centro activo

2. INTERACCIN PROTENA-LIGANDO
Una protena une ms de una molcula de un mismo ligando

K1

P
K2

P
K3

L
L

K4

K1 < K2< K3< K4 Cooperatividad positiva

K1> K2> K3> K4 Cooperatividad negativa
K1 = K2 = K3 = K4 No cooperatividad
Tratamiento de Scatchard permite calcular el nmero de sitios
de unin por molcula de protena, la constante de unin
protena-ligando y el tipo de cooperatividad

2.1. FUNCION DE SCATCHARD

La funcin de Scatchard, , se define como la razn entre la
concentracin de ligando-unido y la concentracin total de
protena
[Ligandounido}
= -----------------------[Protena]
- Esta funcin es diferente de la funcin de saturacin, que
representa el nmero de sitios ocupados partido por el nmero
total de sitios de unin que tiene la macromolcula.
N Sitiosocupados
Y = -----------------------N totalsitios

N sitios = (concentracin de protena) x (numero de sitios por

mol de protena)
No total sitios = [P] n

En esta ec.

=Y n

Se deduce la relacin
funcin de Scatchard
y Saturacin

--> funcin de Scatchard

Y --> funcin de saturacin
n --> n sitios por mol de protena

Para deducir la ecuacin de Scatchard consideraremos una protena P, con

dos sitios de unin para el mismo ligando, L, que se unen independientemente
y con la misma afinidad a ambos sitios.

En el sistema no existe cooperatividad,

K1 = K2 = K3 = K4=K
P

K1

K3

K2

K4
L

[Ligandounido}
= -----------------------[Protena]

PL 2 PL2
v
P PL PL2
Po P PL PL2

La funcin de Scatchard para dos lugares equivalentes viene definida por :

Deduccin Enzimologa. Pgina 224 Nuez de Castro 2001

Para

K[L]
= 2
----------------1 +n K[L]
un nmero
de lugares equivalentes de unin

K[L]
= n
----------------1 que
+ K[L]
n nmero de ligandos
pueden unirse por molcula de protena
K es la constante de equilibrio de unin del ligando a cada centro (es la
misma para todos los lugares de unin n que tenga la protena
[L] es la concentracin de ligando libre

2.1.1. Linearizacin de la ecuacin de SCATCHARD

K[L]
= n
----------------1 + K[L]

v(1 K L ) nK L
v vK L nK L

Dividendo por [L] y despejando

[L]

= nK - K

Representacin de Scatchard para una protena que

tiene 4 lugares de unin equivalentes

No cooperatividad
mM-1

m= -K

[L]

K es la constante de equilibrio de
cada uno de los sitios de unin

PERMITE
CALCULAR
NMERO DE
LIGANDOS QUE
SE UNEN POR
MOLCULA DE
PROTENA

Linearizacin de la ecuacin de SCATCHARD

Cuando las grficas se desvan de la linealidad

Protenas presentan cooperatividad

Cooperatividad positiva

mM-1

[L]
n

Cooperatividad negativa
1

Clculo: EQUILIBRIO DE DILISIS, CENTRIFUGACIN

2.2. TRATAMIENTO DE HILL

Enzimas presentaban cinticas de saturacin respecto al substrato se
desviaba del comportamiento hiperblico michaeliano
Semejanza
Cintica sigmoidal
Curva de saturacin de la hemoglobina

K [Po2]nh
Y = -----------------1 + K [Po2]nh

Y es saturacin
Po2 presin parcial de oxigeno
K constante de formacin del complejo oxihemoglobina

K` = [Po2]nh0.5

[Po2]nh
[Po
]
0.5 Presin da
2
Y = -----------------K` + [Po ]nh

una saturacin de 0,5

nh ndice de Hill valor experimental

(hemoglobina 2,8)

Tratamiento de Hill
Aplicada a las enzimas con cintica sigmoidal
v
Y = -----------Vmax

Saturacin de la enzima

Snh
Y = ------------Snh0,5 + Snh

[Po2]nh
Y = --------------K` + [Po2]nh

S0,5 Concentracin substrato la saturacin

es igual Vmax

nh igual a 1 es una saturacin hiperblica michaeliana

S0,5 = Km
S
Y = ----------- =
S0,5 + S

nh>1 Cooperatividad positiva

nh<1

Cooperatividad negativa

v
-----------Vmax

S
= ----------Km + S

vo

nh<1

nh=1

nh>1

Vmax Snh
vo = ----------------Snh0,5 + Snh

S
nh>1

nh=1

nh<1

1/S

1/S

1/S

1/vo

2.2.1-Linearizacin de la ecuacin de Hill

S nh
nh
nh
nh
S

S
Y
S
0,5

nh
nh
S
1 Y
S 0,5
1 nh
S 0,5 S nh
Y
log
nh log S nh log S 0,5
1 Y
Y
vo

1 Y V max vo

Reaccin enzimtica la
fraccin de saturacin

v
Y
V max

vo
log
nh log S nh log S 0,5
V max vo
Representando la ecuacin lineal

La ecuacin de una recta pendiente es el ndice de Hill

vo
log
V max vo

Log[S0,5]
m = nh
0
Obtencin valor experimental del ndice de Hill
Deducir la existencia de cooperatividad
Valor de S0,5

log [S]
S0,5 Concentracin substrato para la cual la saturacin es igual
a de la velocidad mxima

2.2.2. Razn de saturacin Rs. Significado biolgico de la

cooperatividad positiva y negativa.
Rs, la razn de las concentraciones de substrato que dan como
resultado el 10% y 90% de saturacin
Enzima michaelianas es
constante e independiente
S 0,9
de Km y Vmax
Rs = ----------S 0,1
Snh 0,9
Y = 0,9= -----------------Snh 0,5 + Snh 0,9
Snh 0,1
Y = 0,1= -----------------Snh 0,5 + Snh 0,1

0,9 Snh 0,5 = 0,1 Snh 0,9

0,1 Snh 0,5 = 0,9 Snh 0,1

9=

0,1 Snh 0,9

S 0,9

nh

0,9 Snh 0,1

Rs = ---------- =
S 0,1

81

nh = 1,0 valor de Rs es igual a 81

nh = 2,0 el valor de Rs es igual a 9,0

No cooperatividad
Cooperatividad positiva

nh = 0,5 el valor de Rs es igual a 6531 Cooperatividad negativa

Enzimas con cooperatividad positiva, un cambio en la
concentracin de sustrato de 9 veces hace que la enzima pase de
una saturacin del 10% al 90% Interruptores metablicos
Enzimas con cintica hiperblica, ndice de Hill 1 se necesita
aumentar 81 veces
Enzimas con cooperatividad negativa, para que la enzima pase
de una saturacin del 10% al 90% se necesita aumentar 6561
veces. Amortiguadores de las variaciones de la [S].
Ej fosfatasa alcalina de E.coli suministra fosfato inorgnico.

3.MODELOS PROTENAS ALOSTRICAS.

Protena alostricas actividad esta regulada por la unin no
covalente y reversible de moduladores: Se unen a sitios
distintos al sustrato
Transicin alostrica hace referencia a transduccin de
una seal a un lugar diferente ocupado por esa seal en la
protena.
Efecto alostrico: Cambios conformacionales en una
enzima dan lugar a aumento o inhibicin de la actividad
Transicin alostrica homotrpica
cuando induce cambios en la unin del
mismo tipo de ligando
Transicin alostrica heterotrpica
cuando induce cambios en la unin del
otro tipo de ligando
Hill no era posible determinar con exactitud las constantes de disociacin y las constantes alostricas

3.1. Modelo concertado de Monod, Wyman y Changeaux

1. Las protenas alostricas son protenas oligomricas
2. Las subunidades (protomeros) ocupan posiciones equivalentes,
de manera que dentro del oligmero, existe al menos un eje de
simetria.
3. Cada protomero posee un sitio de unin (solo uno) para cada
uno de los diferentes ligandos: Activadores o inhibidores
3. El oligmero puede existir en dos estados conformacionales,
que designaremos por R (relajada, alta afinidad) y T (tensa,
baja afinidad) y que presentan afinidad diferente por un ligando
dado.

Relajada, alta afinidad

Tensa, baja afinidad

4. La conformacin de la protena cambia de de la forma R a la

forma T (o viceversa) se conserva la simetra del oligmero.
Los cambios R
T son concertados, no hay formas
hbridas, compuestas por subunidades (R-T)
* Si representamos la conformacin de las subunidades en forma
T y R por un circulo y un cuadrado respectivamente, existe el
siguiente equilibrio:

T
Tensa, baja afinidad

T
L
R

Relajada, alta afinidad

5. No existirn especies hbridas (TR) ya que en tal caso se

perdera la simetra del oligmero.
*En otras palabras, todas las subunidades cambian de
conformacin de una manera concertada, lo que le ha dado
tambin nombre al modelo: Modelo concertado.
6. Las formas R y T pueden poseer diferente capacidad cataltica
(siendo kcR y kcT las constantes catalticas de las formas R y T,
respectivamente) o diferentes afinidades por los ligandos
sustratos, activadores o inhibidores.
KR y KT constantes de disociacin intrnsecas de cada uno de los
protmeros de las formas R y T y el Substrato.
* En la siguiente figura, se representa el modelo concertado ms sencillo de
una protena dimrica que tiene un activador A, y un inhibidor I:

S
I

S
I

L cte de equilibrio entre las dos formas R y T.

I
[T]
L=
------------

Saturacin por ligando

[R]

0.0
KT

KR
S

KR

KT
P

kcT

0.5

Clculo de Y
Enzimologa. Nuez de
Castro
Pg 237

1.0
kcR

Parmetros describen el estado de un sistema alostrico

Y La funcin de saturacin, la hemos definido anteriormente

como la razn entre el nmero de sitios ocupados partido por el
nmero total de sitios. Y= v/Vmax

L cte de equilibrio entre las dos formas R y T en ausencia de ligando.

n

[T]

nmero de sitios de unin

= ------------

c constante ratio de las dos constantes de disociacin

Concentracin de ligando libre

[S]
= -----------KR

L c (1+ c )n-1 + (1 + )n-1

Y=
L (1+ c )n + (1 + )n-1

[R]
KR
c = -----------KT

3.1.1.Enzimas alostricas modelo tipo K

Relajada

Tensa

Misma constante cataltica kcR = kcT

KR

R mayor afinidad por el sustrato KR <<<KT

C

c = ------------

L c (1+ c )n-1 + (1 + )n-1

(1 + )n-1

Y=

KT

Y=
L (1+ c )n + (1 + )n

L + (1 + )n

Ecuacin
sigmoidal

 (1 + )n-1
Y=

Y
L= 0

L + (1 + )n

L=0

L= 10

No hay equilibrio de transconformacin

L = 100

(Todo esta como R)

L =1000

la ecuacin queda reducida a Ec. M-M

Y=
(1 + )

S
S
v
Y Km

S
Km S V max
1
Km

Velocidad mxima no se ve alterada

V max S
v
Km S

La presencia del ligando afecta la afinidad del enzima por el sustrato

Modifica la Km Cambia la concentracin de substrato para la cual
la saturacin es semimxima
Inhibidor desplaza el equilibrio hacia la forma T (KR <<<KT)

Km

Activador desplaza el equilibrio hacia la forma R

Km

3.1.2.
Enzimas
Enzimas
alostricas
alostricas
modelomodelo
tipo Vtipo V

Relajada

Tensa

Diferente constante cataltica kcR = kcT

KR

Igual afinidad por el sustrato KR = KT

C

c = ------------

L c (1+ c )n-1 + (1 + )n-1

Y=
L (1+ c )n + (1 + )n

Saturacin hiperblica

KT

Y=
1+

Accin de los moduladores (activadores e inhibidores)

sobre la Vmax

v
V max

Vmax = kcR R + kcT T

Suma de la contribucin a la velocidad de la forma
transconformada R y de la forma transconformada T

vo

VmaxA
Vmax

Vmax I

Km

S
Fosforilasa b

activada por AMP

Aspartato quinasa (EC 2.7.2.4) de E.coli inhibe por

lisina

3.1.3.Enzimas alostricas modelo tipo K mixto

Tanto la constante cataltica como la afinidad (Km) cambian
Resumen modelo MWC
- Sencillo
-Modelo da cuenta del comportamiento de protenas que
muestran cintica sigmoide y que son oligomericas.
- Se adecua a la accin de activadores e inhibidores alostricos
Limitacin
No explica el compartamiento cintico de aquellas protenas
que tienen cooperatividad negativa.
NOTA: Cintica sigmoide no es sinnimo de alosterismo. Hay protenas con cintica
sigmoide no alestericas y enzimas alostericas con cintica hiperblica (enzimas alostricas
tipo V puro)

3.2.Modelo secuencial de Koshland, Nemethy y Filmer

Ligando unido a uno de los protomeros induce un cambio conformacional

Ajuste
inducido
de Kosland Entrada de un segundo ligando

1.

Cooperatividad
positiva

Cooperatividad
negativa

Permite la presencia de formas hbridas, (prohibido en el modelo

concertado)

2. Explica tanto la cooperatividad positiva como negativa

3. Modelo concertado , sera un caso particular del modelo secuencial, en el
que se explica nicamente la cooperatividad positiva.

RESUMEN
TRATAMIENTO DE SCATCHARD
El tratamiento de Scatchard permite el estudio de la unin de una protena con varios ligandos.
La representacin linealizada de la ecuacin permite obtener el nmero de ligando que se
unen por mol de protena, as como la afinidad de los lugares de unin.
El signo de la cooperatividad se puede obtener de la representacin linealizada
ECUACIN DE HILL
Derivada del estudio de la saturacin de la hemoglobina es til para explicar la saturacin no
hiperblica que se da en enzimas que se desvan del comportamiento Michaeliano,
monstrando curvas sigmoidales, con cooperatividad positiva, o hiprbolas no equilteras
(curvas de cooperatividad negativa).
El ndice de Hill (nh) es un parmetro experimental y no tiene que ser un nmero entero.
RAZON DE SATURACIN
La razn de saturacin (Rs) entre concentraciones de substrato para dar una saturacin del
90% a una concentracin de substrato para la obtencin de una saturacin del 10% es 81, en el
caso de las protenas con cinticas michaelianas; es mucho menor para protenas con
cooperatividad positiva, y muchsimo mayor para protenas con cooperatividad negativa.
Enzimas con cooperatividad positiva puede comportarse como un interruptor metablico; por
otra parte, una protena con cooperatividad negativa puede servir para mantener el mismo flujo
a pesar de las posibles variaciones en la concentracin de substratos.

MODELO ALOSTRICO CONCERTADO

Modelo propuesto por Monod, Wyman y Changuex. Explica de forma clara y elegante la
mayor tipo de procesos alostricos de regulacin.
Esquema mecnico simple, protenas oligomricas, con ejes de simetria
Clasifica en tres tipos de enzimas alostricas.
Tipo K, son protenas oligomricas que presentan cooperatividad positiva, asi como la
accin de inhibidores y activadores.
Tipo V explica igualmente la accin de activadores e inhibidores sobre la velocidad
mxima sin cambiar la constante de afinidad por el substrato.
Tipo mixto, una mezcla de ambos modelos.
MODELO ALOSTRICO CONCERTADO
Modelo ms potente , tiene mayor complejidad , no es muy utilizado en
Enzimologa .
Prctica el instrumento ms utilizado es el ndice de Hill