FACULTAD DE ESTUDIOS

SUPERIORES ZARAGOZA
LABORATORIO DE
INMUNOLOGIA CLINICA
ELISA
Alaniz Salinas Michel Andrea
Barrera Velzquez Gerardo
Chvez Betancourt Adriana
Cortez Galindo Dennis
Mendoza Romn Mayda

ELISA
(Ensayo de Inmunoadsorcion Ligada a
Enzima)

Se basa en dos fenmenos biolgicos

1.- La elevada afinidad de los Ab
2.- La alta actividad de algunas
enzimas usadas, que permiten la
amplificacin de la seal generada por
la muestra

Clasificacin de
Enzimoinmunoanalisis

a. Homogneo
b. Heterogneos

Homogneos

Se realizan exclusivamente en fase liquida

Heterogneos

Se emplea un soporte solido para

inmovilizar a uno de los inmunoreactantes

Sencillez
y aplicabilidad
.

Amplificacin:

(No
competitivo)
Se emplea un gran exceso de
inmunoreactante con el objetivo de
obtener una seal mxima debida a
la presencia del compuesto a ser
usado

Un exceso de inmunoreactante
permite detectar niveles bajos de
analito que se requiere
determinar

 Modulacin:

(competitivo)

Se modula la actividad del conjugado

enzimtico por competicin con el
analito
Menores cantidades del conjugado
enzimtico
permiten
obtener
una
deTectibilidad mayor, ya que pequeas
cantidades del competidor tienen gran
impacto sobre la actividad enzimtica
determinada en la fase solida

Inmunoensayos en fase
solida
Independientemente de la estrategia
utilizada se distinguen 3 etapas
a) Inmovilizacin del inmunoreactante (Ab o
Ag) en fase solida
b) Incubacin con la muestra de modo que
esta reaccione con el inmunoreactante
inmovilizado
c) Amplificacin o modulacin por medio de la
utilizacin de un conjugado enzimtico.

Fundamento
ELISA

 Fosfatasa alcalina
Peroxidaza de rabano
picante
Galactosa

Una enzima conjugada con un

Ab reacciona con un sustrato
incoloro
para
generar
un
producto con reaccin de color
Cromogeno

Basada en la deteccin de un Ag
inmovilizado sobre una fase slida
mediante Ac que directa o indirectamente
producen una reaccin cuyo producto,
puede ser medido
espectofotomtricamente.

Enzimas empleadas y criterio de seleccin

Enzimas y sustratos cromognicos

deben reunir ciertos requisitos
Tiempo de incubacin con sustratos;
10-30 minutos
Reacciones
enzima-sustrato
se
detienen por agregado de bases o
cidos

Caractersticas que deben reunir enzimas

Estables durante su almacenamiento

Fcil preparacin, elevada pureza y
bajo costo
Actividad enzimtica alta y detectable
Compatibles con condiciones del
ensayo
Fcilmente conjugables con anticuerpo

Peroxidasa:
Hemoproteinas que transfieren
desde un donante (DH) al H2O2
HRP o horseradish peroxidase
En etapa de revelado se utilizan
donantes de H, para que el
cromgeno o producto formado
sea soluble y cuantificable por
espectrofotometra

2,2-azino-di-(3-etil-benzotiazolina)6-sulfonato de diamonio (ABTS)

Producto oxidado, mx. Abs=
414nm

Fosfatasa alcalina:

- Aislada del intestino bovino o de E.

coli
Hidroliza esteres de fosfato
Tienen pH alcalino
Requieren de Mg y Zn como
cofactores
Sustrato:
para-nitrofenilfosfato (pNPP)
p-nitrofenol ( producto de
hidrolisis)
absorbe a 450nm

Ureasa:

Empleada para establecer el punto

final en una titulacin por
determinacin visual
La reaccin catalizada por la
enzima es la hidrolisis de la urea
con formacin de CO2 y NH3

Ureasa + purpura de
coloracin
bromocresol
purpura
.

PRINCIPIO DE INMUNO ENSAYO

ABSORBENTE EN FASE SLIDA
DIRECTO

POCILLO DE MICROTITULACIN

PARTICULAS

Medios en fase solida para

la tcnica de ELISA

POLIESTIRENO
CLORURO DE PILIVINILO (PVC)
NYLON
POLIPROPILENO
NOTROCELULOSA
CELULOSA
GOMA DE SILICONA
VIDRIO
SPIA

TIPOS DE ELISA.

Directo.

Indirecto.

Tipo
sandwich
antgenos.

Competitivo.

captura

de

ELISA DIRECTO.

ENSAYO
CAPAS:

Las placas se recubren los pocillos con

las soluciones problema de Ag.
Incubar con Ac marcados.
Es necesario incluir controles negativos
(muestras con ausencia del Ag).
Se
incluyen
controles
positivos
(soluciones donde se encuentra el Ag
buscado, o bien aadido).

ELISA

SIMPLE

DE

DOS

ELISA INDIRECTO.

Las placas se preparan de forma idntica a la

anterior.
Los controles positivos y negativos.
El sistema de deteccin emplea dos Ac:
primario contra el antgeno.
secundario marcado contra el primario.
Mayor sensibilidad por amplificacin de seal
(por unin de 2 ms Ac secundarios por
cada primario).

(1) El antgeno se
pega a la placa.

(2) Aadir el
suero problema.

(3)
posteriormente,
el conjugado.

(4) por ltimo, el

sustrato.

ELISA SANDWICH.

ENSAYO DE CAPTURA DE ANTGENO Y DETECCIN

MEDIANTE INMUNOCOMPLEJOS:
Se recubre el pocillo con un primer Ac anti-Ag o Ag antiAc

Aplicar la muestra problema en la que se encuentra

elAg (ser retenido al ser reconocido por el 1er Ac.

Se aplica una solucin con un 2 Ac anti-Ag marcado.

As pues un Ag + un Ac + un2 Ac al menos, que lo

marca.

(1)
Un
anticuerpo
monoclonal o policlonal
anti-Ag unido a la placa.

(2) se incubar con la

muestra problema.

(3)
se
aadir
conjugado.

el

(4)
por
sustrato.

el

Todos los pasos van

precedidos
de
incubaciones y lavados.

aadir

ELISA COMPETITIVO.

En este sistema se parte de un Ac

(monoclonal o policlonal), frente a un Ag
conocido, previamente ha sido inmovilizado
en la placa.

Se denomina de competicin ya que el suero

problema es incubado previamente con el Ag,
antes de incubarlo con el anti-suero fijado en
la placa, y por tanto compite con l.

(1) Se incuba el suero

problema con el
antgeno.

(2) Depositar la mezcla

anterior sobre los
pocillos donde
previamente se ha
fijado un suero antiantgeno.

(3) se aade el
conjugado.

(4) despus, el
sustrato.

En este caso la
ausencia de color sera
positivo

Aplicaciones clnicas

Aplicaciones clnicas

VENTAJAS Y DESVENTAJAS
DE LA TECNICA DE ELISA
MTODO
VENTAJAS
Se utilizan pequeas cantidades de reactivos.
Incrementa la tasa de reaccin dependiendo del
medio utilizado.
Estable cuando se almacena y manipula
adecuadamente.
Puede almacenarse a 4C por ms de 6 meses.
Hay variedad de sustratos a utilizar amplia
variedad de substratos comerciales disponibles

Desventajas

Es costoso.
En algunos casos hay impedimento
estrico( fosfatasa alcalina) a
diferencia de la peroxidasa.
Se inactivan por agentes quelantes.
Es un proceso largo.

Mtodo

Deteccin de ELISA se divide en dos sesiones.

1. preparacin del antgeno
2.titulacin de conjugado de peroxidasa unido
a un Ac de chivo anti cadenas y humanas.

a
A

D E

Mtodo

Tubo A 3mL-solucion de IgG

DE 128
g/mL-realizar diluciones de
1.5 mL-disuelta en
amortiguador de
recubrimiento B-G(3.0 mL)

desechar y lavar 4 veces

con PBS-tween

Eliminar
sobrenadan
te,
bloquear
con
albumina
srica
bovina 1%

Mtodo

Colocar en cada pozo

100L

Enumerar del 1-11-realizar

diluciones al doble PBS del
conjugado de peroxidasa anti IgG
humana-comenzar dilucin 1.500,
usar vol. 1 mL

Leer 490 nm

REFERENCIAS

Daz J. Fernndez M. Paredes F. aspectos

bsicos de bioqumica clnica. Ed Daz de
Santos. Espaa. 1996.
Ochoa R. tcnicas inmunoenzimaticas para
ensayos clnicos de vacunas y estudios
inmunoepidemiolgicos. Ed. Serie
monogrfica. Cuba. 2012.
Fuentes X. Castieiras M. Queralto J.
Bioqumica clnica y patologa molecular. Vol.
1. 2da. Edicin. Ed. Revert, S.A. Espaa.
1998.