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MORELIA
CARRERA: INGENIERIA EN AGRONOMA
ASIGNATURA: MICROBIOLOGA
TEMA: PREPARACIONES PARA
MICROSCOPIA, TIPOS, TECNICAS Y
PRESERVACIN.
PREPARACION Y TINCION DE LA
MUESTRA
Aumentar la resolucin
Acentuar caractersticas morfolgicas
Conservar la muestra
PREPARACION (FIJACION)
En este proceso se fijan en su
posicin las estructuras internas y
externas de la clula.
Mata al microorganismo y se fija al
portaobjetos
Por
calor:
Preservar
morfologa
general pero no las estructuras
internas.
Qumica: Proteger la sub-estructura
fina
y
la
morfologa
de
los
microorganismos delicados.
Las
preparaciones
microorganismos vivos.
en
fresco
se
utilizan
para
observar
Los frotis.
En ocasiones, la concentracin de clulas en una
muestra puede ser muy elevada, o por su
naturaleza encontrarse muy aglutinadas.
Para extenderlas sobre un portaobjetos
poderlas observar bien se preparan los frotis.
Para realizar un frotis, ya sea
suspensin celular, suspensin
bacteriano, etc.
de
de
sangre,
cultivo
2.2.1 Tipos
Un microscopio optico utiliza la luz visible como fuente de
iluminacin. Posee dos sistemas de lentes; lente ocular y lente
objetivo.
Los microscopios pticos compuestos estn provistos de varios
objetivos:
Tipos de microscopa
Microscopa ptica normal: El
material a observar se colorea
con colorantes especficos que
aumentan el contraste y revelan
detalles.
Microscopa
de
campo
brillante:
Se
observa
sin
coloracin.
La
luz
pasa
directamente y se aprecian
detalles naturalmente coloreados
Microscopa
de
campo
oscuro: Produce una imagen
iluminada del objeto sobre un
fondo oscuro. Se emplea para
observar organismos vivos en
preparaciones sin teir.
Microscopia de fluorescencia:
El contraste se aumenta por medio de la fluorescencia.
El microscopio debe modificarse con filtros especiales para
iluminar la preparacin con luz ultravioleta de longitud de
onda corta.
(Esta es la propiedad que tienen algunos materiales de
absorber luz de una determinada longitud de onda y
devolverla con una longitud de onda mayor).
Microscopa
de
Nomarsky;
[microscopa
diferencial de contraste de interferencia
(DIC) ] :
Proporciona contraste por interferencia, como lo
hace el contrate de fases, pero produce una imagen
semejante a las tridimensionales, con ms detalle.
Se usa cuando el espcimen es muy grueso para
usar contraste de fases.
Utiliza dos rayos de luz polarizada, fue diseado para
observar relieves de especmenes muy difciles de
manejar, es muy utilizado en los tratamientos de
fertilizacin in-vitro.
2.2.2 Tcnicas
TINCIONES
Los colorantes son compuestos
qumicos utilizados para aumentar
el contraste. La mayora slo son
efectivos si los microorganismos
han sido fijados.
Un mordiente es un compuesto
que recubre la estructura para
hacerla mas visible.
Colorantes
bsicos:
cargados positivamente
iones
Colorantes
cidos:
cargador negativamente
iones
2.2.3 Preservacin
Mantenimiento bajo capa de aceite
Simple y efectiva
Consiste en cubrir el cultivo (medio slido) con
una capa de aceite mineral o vaselina.
Pueden conservarse por periodos de tiempo
largos (varios aos) a temperatura ambiente.
Pueden ocurrir mutaciones, luego de los 3 aos
de mantenimiento.
Desecacin:
La eliminacin del agua (deshidratacin) es un
mtodo de conservacin que reduce drsticamente
el metabolismo.
No todos los microorganismos sobreviven a estos
mtodos de secado, por lo que se hace necesario
aadir agentes protectores (leche descremada,
glutamato sdico al 10%).
Es importante mantener el producto sellado (tapn
de rosca o ampolla) para evitar el contacto con el
aire ya que son higroscpicos.
Arena
Suelo
Gel de slica
Discos o tiras de papel
Agar
Discos de gelatina
Estos deben ser previamente secados y
esterilizados por calentamiento con aire caliente
seco.
Congelacin:
Bajar la temperatura hasta el punto de congelacin o por debajo de ste se reduce el
metabolismo drsticamente hasta el caso de prcticamente anularlo con nitrgeno lquido (196C).
La formacin de cristales de hielo (pueden romper las clulas), para evitar esto se deben
utilizar:
Suspensiones que contengan el mnimo de sales posibles
Agentes protectores como el glicerol (25%) o dimetilsulfxido (DMSO al 10%) que neutralizan
el efecto de las sales.
Algunos recomiendan una bajada gradual de temperatura (1C/min) hasta -20C para luego
enfriar rpidamente. La descongelacin debe ser rpida.
Crioprotectores:
Glicerol 10%
Dimetilsulfxido
Glucosa
Dextranos
Sacarosa
Lactosa
Extracto de malta
Liofilizacin:
Es el mtodo ms utilizado por las colecciones internacionales
de cultivos de microorganismos.
Consiste en congelar rpidamente una suspensin de
microorganismos y eliminar el agua como vapor de agua
directamente del hielo sin pasar por el estado lquido.
El sistema requiere tres componentes:
Mecanismo de congelacin
Bomba de vaco
Una trampa de agua.
Los microorganismos lifilizados se conservan entre 0y 5C
durante muchos aos.
Para su recuperacin se resuspenden los organismos en el
medio de cultivo adecuado y se incuban a la temperatura
adecuada.
Algas y cianobacterias
La mayor parte de los cultivos se han mantenido
como subcultivos seriados a temperaturas entre
10y 15C.
Para crecer estos cultivos se necesita luz, ya que
son fotosintticos.
Las algas no toleran bien la liofilizacin ni la
desecacin.
Con relacin a la congelacin los mejores
resultados se obtienen con nitrgeno lquido.
Bacterias
Prcticamente se han usado todos los mtodos
conocidos con buenos y malos resultados, aunque
en lneas generales el mejor mtodo es la
liofilizacin debido a su facilidad de transporte.
Virus
Se han utilizado todos los mtodos, pero
obteniendo en lneas generales baja estabilidad.
Se recomienda para su conservacin durante
largos perodos de tiempo el nitrgeno lquido.
Hongos
La mayora de los hongos pueden conservarse
por desecacin en suelo.
Bibliografa
INGRAHAM, John L y Catherine, Introduccin a la Microbiologa, Editorial Revert, S.A.
Barcelona, Espaa, 1998.
http://
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http://iespoetaclaudio.centros.educa.jcyl.es/sitio/upload/manual_microscopio.pdf