Aislamiento y Cultivo de

Microorganismos

 El
estudio
de
los
microorganismos se dificulta
por su tamao.
En condiciones in vitro, es
necesario estudiarlos no como
individuos, sino como una
poblacin.
Colonia microbiana: Poblacin de
microbios compuesta de millones
de individuos que comparten sus
caractersticas
genticas
y
fenotpicas.
En medio slido son claramente
visibles, presentado morfologa y
colores variados.

Adems, los microorganismos

tienen que estar en forma de
cultivo puro.

Generalidades

Requisitos para obtener un cultivo puro

Poseer un medio de cultivo estril, adecuado para el tipo
de microbios que se va a cultivar.
Disponer de recipientes adecuados para contener el
medio de cultivo.
Aislar el microbio deseado de una poblacin mixta.
Mantener condiciones de trabajo estriles.
Esterilizar la "boca" de los recipientes antes de introducir
o sacar material.
Trabajar en una cmara de aislamiento, o al menos muy
cerca de la llama de un mechero.

Tipos de medios de cultivo

S en polvo

10.0 g

(NH4)2SO4

0.4 g

K2HPO4

4.0 g

CaCl2

0.2 g

MgSO4.7H2O

0.5 g

= Medio bsico

FeSO4.4H20

0.01g

La composicin qumica exacta

se desconoce.

Agua

Sinttico
La composicin qumica del
medio se conoce con exactitud.
Bacterias del azufre

Complejo

Agar nutritivo
hetertrofas

bacterias

Agar papa dextrosa (PDA)

hongos

1000 ml

Extracto de carne

3.0 g

Peptona

5.0 g

Agar

15.0 g

Agua

1000 ml

Tipos de medios de cultivo

Enriquecido
Para aquellos que requieren nutrientes especficos
Sangre, extractos de tejidos de animales, plantas, suelo.

Selectivo
Medio bsico o enriquecido al que se aaden sustancias que
impiden el crecimiento de ciertos tipos de microbios
Antibiticos, vitaminas, fuentes especficas de C y N

Diferencial
Medio bsico o enriquecido al que se aaden sustancias que
permiten identificas tipos especficos de microbios
Colorantes, sustancias indicadoras

Preparacin de medios de cultivo

Se pesa cada ingrediente, o el medio deshidratado
completo
Se disuelve en la mitad del volumen, con agua destilada.
Se determina el pH (papel indicador, potencimetro) y, de
ser necesario, se lo corrige al valor adecuado.
Se dispensa en recipientes adecuados
Se aade la cantidad respectiva de agar
Se esteriliza, generalmente en autoclave.

Aislamiento y cultivo en
medios slidos
Los
microorganismos
forman colonias.
Comnmente usado para
bacterias y hongos.

Cultivo en estras
Estras simples

Cultivo en estras
Estras compuestas

Vertido y difusin en placa

Es necesario realizar diluciones.
Para la difusin en placa se requiere cajas petri con medio slido.
En el vertido en placa se requiere que el medio con agar se
encuentre lquido.

RECOMENDACIONES TCNICAS
- Iniciar el anlisis tan pronto sea posible, despus de
haber llegado la muestra al laboratorio
- Si las muestras llegan congeladas deben mantenerse en
este estado hasta su anlisis y deben analizarse en un
periodo no superior a 7 das.
- Las muestras congeladas se deben descongelar para su
anlisis en un envase original durante un tiempo mximo
de 18 horas en un refrigerador entre 2 5 C, y comenzar
el anlisis una vez conseguida la descongelacin
completa.

- El material a utilizar en el anlisis, debe ser esterilizado

con anterioridad al procesamiento o anlisis de las
muestras.
- Se deben preparar los medios de cultivo de acuerdo con
el nmero de muestras a analizar.
- Marcar las cajas y tubos con el nmero correspondiente a
cada muestra por analizar.
- Trabajar lo ms cerca posible al mechero, flameando la
boca de los frascos y tubos.
- Desinfectar con alcohol antisptico, el sitio donde se
vaya a extraer la muestra para la preparacin de las
diluciones.

- Utilizar una pipeta por dilucin.

- El tiempo transcurrido entre la preparacin de las
diluciones y el vertido del medio no debe superar los 20
minutos, es preferible que sea inferior a los 10 minutos.
- La temperatura del medio debe ser la correcta (45 50
C) de tal manera, que al mezclarlo con la dilucin no
sean inactivados los grmenes.
-

Hacer siempre controles de esterilidad del medio de

cultivo y del agua de dilucin empleada.

Mtodos de Esterilizacin

Esterilizacin por calor

Calor Seco
Realizado principalmente en estufas.
Requiere temperaturas altas (160 200oC). Los tiempos de
esterlizacin pueden variar, pero generalmente son de varias
horas.
Usado para materiales de vidrio y otros resistentes al calor.

Calor Hmedo
Se necesita de un autoclave.
Se necesita subir la presin a 1.0546 Kg/cm2 (15 lb/pulg. 2) para
alcanzar una temperatura de 121oC. Comnmente, el tiempo de
esterilizacin vara entre 15 a 20 minutos.
Medios de cultivo, material de vidrio, soluciones acuosas,
suelo.

AUTOCLAVE: Aparato que cierra hermticamente y en su

interior desarrolla vapor bajo presin, el cual se presuriza y
eleva la temperatura, proporcionando que el calor hmedo
destruya a lo m/o
Existen dos tipos: Gravitacional y de pre-vacio

CICLOS

DE

ESTERILIZACIN..

Esterilizador gravitacional
Temperatura: 121 C.
Humedad: 90%.
Tiempos: (Total 45 del ciclo).
Para el llenado de la cmara: Hasta alcanzar la temperatura
adecuada, 5.
Exposicin: 20 para la penetracin de vapor a los paquetes.
Expulsin de vapor 5 para la completa.
Secado y enfriamiento de los paquetes: 15.

Esterilizador de pre-vaco
Temperatura: 133C.
Humedad: 90%.
Tiempos: (Total 20 del ciclo).
Para el pre-vaco y alcanzar la temperatura adecuada: 6.
Exposicin: 4.
Secado y enfriamiento de los paquetes: 10.

Ciclos de esterilizacin de acuerdo al tipo de producto

En trminos generales, los tiempos de exposicin para
diferentes productos son los siguientes:
INTRUMENTAL
-Lapso de 20 a 30 minutos a temperatura de 121 C
TELAS, ALGODONES, BATAS
-Lapso de 30 minutos a temperatura de 121 C
ARTCULOS DE CRISTAL
- Lapso de 20 minutos a temperaturas de 121 C

ESTERILIZACIN POR CALOS SECO

Por calentamiento lento cuagula las protenas celulares de
los m/o, causndoles la muerte.
CICLOS
-Una hora a temperatura de 171 C
-Dos horas a temperatura de 160 C
-Tres horas a temperatura de 140 C

Esterilizacin por agentes qumicos

El compuesto usado tiene que cumplir con dos condiciones:
Txico, para eliminar a los microorganismos.
Voltil, para que pueda eliminarse fcilmente

El xido de etileno es muy usado. Su punto de ebullicin es de

10oC. Es muy inflamable por lo que se lo diluye en CO 2 o Fren.
Usado para la esterilizacin de alimentos y artculos usados en
medicina.
Se realiza en equipos adecuados y tiene que esperarse un
tiempo (generalmente 24 horas) adecuado antes de ser
consumido.
Destruye incluso las endosporas de las bacterias.

Esterilizacin por filtracin

Usado para materiales sensibles al
calor.
Enzimas
Vitaminas
Antibiticos

Se requiere de un equipo de
filtracin
Dimetro de poro vara (0.1 10 m)

Los microbios son retenidos por

su tamao y por adsorcin al
material del filtro.
No sirve para virus

Esterilizacin por radiacin

Ultravioleta (150 300 Ao)
Baja penetracin.
Esterilizacin superficial.
Destruye protenas y cidos nuclicos.
Daino para ojos y piel.

Rayos infrarrojos (5x105 106Ao)

Alta energa trmica.
Muy usado en la industria alimenticia.

Rayos Gamma (0.01 1A)

Radiacin ionizante provocando iones o
radicales libres que se vuelven letales.
Gran poder de penetracin.
Se usa para esterilizar materiales
gruesos. Ej. Alimentos empaquetados.