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Enzymatique
Dr AKSAS
Mesure de lactivit
enzymatique
Cette mesure consiste valuer la
Q de :
S transform ou de P apparu par
unit
de
conditions
temps
dans
opratoires
des
bien
dtermines.
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Mesure de lactivit
enzymatique
Lactivit dune enzyme se
mesure:
1. Soit par la vitesse de disparition dun
substrat.
2. Soit par la vitesse dapparition dun
produit.
3. Soit par la vitesse dutilisation dun
cofacteur.
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Mthodes de mesure
2 Grandes Mthodes
Mthode en point final ou deux points
Mthodes cintiques:
1. Colorimtriques
2. UV : - directes;
- couples
Conditions opratoires
Conditions qui permettent davoir une
vitesse constante et maximale
a) Milieu tamponn pour viter toute variation du PH0
et dterminer la force ionique. Vrifier que le
tampon ne contient pas dinhibiteurs.
b) Milieu thermostat pour stabiliser la temprature
optimale
c) Choix du substrat : grande affinit et concentration
saturante
d) Ajout dactivateurs ou de coenzymes si ncessaire.
e) La dure dincubation
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Le substrat
Le S doit tre pour lequel lenzyme a le plus
daffinit (Km le plus faible)
Pour une [] de S = 10 Km, la Vi= 91 % Vm
Pour une [] de S = 100 Km, la Vi= 99 % Vm
Il en ressort de ces calculs que la [] optimale de S
doit tre > 100 Km
Mais
Un certain nombre de considration pratique :
solubilit du S, prix de revient, inhibition par excs
de S, etc., fait que pour les dosages au labo:
on exige que S > 10 Km.
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Temprature
En biologie chimique trois tempratures sont
conventionnellement utilises : 25, 30 et 37C.
La commission des enzymes de la SFBC (socit
franaise de biologie clinique) prconise la
temprature de 30C .
La dure de la mesure
AE = Vi en [ ] saturante de substrat
Priode initiale, qui est la dure pendant
laquelle une proportion inferieure 10% de la
concentration initiale du substrat a t consomme
= phase stationnaire.
Le Tmoin
Dans les mthodes 2 points
On utilise une prise dessai identique mais dans laquelle on
a inactiv lenzyme.
Ce tmoin est ncessaire lorsque le produit de la raction
que lon dose prexiste dans lchantillon.
Principe du dosage
Cest le procd classiquement utilis en mthode
manuelle. Il consiste :
1. Laisser lenzyme catalyser la raction pendant une
dure dtermine dincubation,
2. arrter son action,
3. Puis ajouter un ractif qui ragit avec le S ou le P et
avec lequel il est capable de donner un produit
color dont lintensit de coloration, lue une
dtermine, est directement lAE.
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La dure de la raction
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Le Tmoin
Faire un tmoin en utilisant une prise dessai
identique mais dans laquelle on a inactiv
lenzyme.
Ce tmoin est ncessaire lorsque le produit de la
raction que lon dose prexiste dans lchantillon
Exemple le dosage du phosphatase srique
avec mesure de phosphate libr
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le
ractif
de
coloration:
Dinitro-2,4
(Dinitrophnylhydrazone );
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graphique
aprs
ralisation
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II - Mthodes cintiques
Principe du dosage
Sadapte parfaitement lanalyse automatique;
Consiste suivre lvolution de la raction en fonction de
temps
La substance dont on mesure la vitesse de disparition ou
dapparition doit possder une proprit spectrale spcifique
dans lUV ou le visible;
lorsquaucune de ces conditions nest runie, on opre
laide de ractions couples appeles ractions indicatrices.
Lenregistrement des variations dabsorbance en f du
temps est la technique la plus simple, la plus rapide et la
plus spcifique.
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couple
NAD/NADH
ou
NADP/NADPH
est
usuellement employ.
La pluparts des enzymes sont mesures par des ractions
en cascades en UV mettant en jeu le couple NAD+/NADH2
qui sont facilement mesurables.
Ces techniques sont rapides, spcifiques et automatisables.
Cette mthode prsente en outre lavantage de pouvoir
vrifier que la vitesse est constante durant la mesure.
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Mthodes cintiques
Dans les mthodes cintiques enregistrement
continu, la dure de raction na pas besoin dtre
fixe avec rigueur .
La raction est dclenche, par addition dun
ractif (appel ractif dclenchant) ou par addition
de lenzyme, aprs avoir attendu que le milieu se
stabilise.
Elle volue et enregistrement de de la courbe :
P = f(t) permet la dtermination de lactivit sur
graphe.
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A + NADH,H +
A + NADPH,H +
laugmentation
deA340nm
LDH
Mesurela
diminution
deA340nm
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DO =
Cl
DO1 = C1 l
C1 = DO1 / l
DO2 = C2 l
C2 = DO2 / l
C = C2 - C1 = (DO2 / l) - (DO1 / l)
= DO / l
AE =
DO/min
.
l
VT
x 106
VE
A 340 nm
NADH,H + = 6300 mol-1. cm-1 .l.
AE en mol/min/l
30
E2
E1
P
NADH,H +
PH2
NAD+
31
32
Malate + NAD+
33
34
E1
V1
E2
E3
V2
V3
NADH,H +
R principale
R auxiliaire
XH2
NAD+
R indicatrice
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CK
cratine + ATP
R auxiliaire:
ATP + glucose
hexokinase
glucose 6P + ADP
R indicatrice:
G6P + NADP+
G6P
Dshydrognase
NADPH,H+ + 6P gluconolactone
Cintique enzymatique
colorimtrique
Exemple: Dosage des phosphatases alcalines (PAL)
p-nitrophnylphosphate
PAL
p-nitrophnol + phosphate
Le substrat = p-nitrophnylphosphate;
Le tampon = dithanolamine+ MgCl2;
Dosage colorimtrique directe du produit form (PNP) 405 nm :
enregistrement des DO des intervalles de temps rguliers (1 min).