Departamento de Ciencias de la Vida

Ingeniera en Biotecnologa
Inmunologa
Tema: Microscopa confocal y TEM

Jos Luis Hernndez

Introduccin

http://cevr.uconn.edu/genome.html

www.backyardchickens.com

Introduccin

Materiales y mtodos

Materiales y mtodos
Cultivo de M. gallisepticum y preparacin de membranas

Materiales y mtodos
Tratamiento de M. gallisepticum con
iodonaptalenos

Materiales y mtodos
Microscopia confocal y de electrones

Microscopia transmisin de electrones

Haz de electrones para visualizar
un objetivo
Aumentan 1milln de veces
Limitado por long de onda de la
luz visible
Pasan travs de la muestra
Recogidos y focalizados por un
lente objetivo
Ampliado por lentes proyectoras

Multiples imgenes a
diferentes longitudes de
onda

Secciones pticas
sencillas

Imagen XZ
Imagen 3D

Materiales y mtodos
Microscopia confocal y de electrones

Microscopia por transmicin de

electrones
Celulas corregidas con 2% de PFA Y 2.5%
de glutaraldeido (30 min en fro)
Desidratacin y osmificacin Epon
Seccionadas usando ultramicrotomo
Observadas

Microscopia confocal
Celulas sanguneas de pollos
Incubadas con PFA o con INA
Lavadas con PBS
Permebilizadas con Triton + PBS
Superpuestas en con anti-M. gallisepticum
fluorescina
Anticuerpos que no se unieron lavados con
PBS

Materiales y mtodos
Aobsoricin de L-arginina

Anlisis de lipoprotenas

Mezclas de clulas lavadas con

Buffer Tris-Mes (diferentes pH)
Cloranfenicol evitar la
incorporacin de arginida en las
protenas
Se paro la reaccin con NaCl fro
0.25M
Muestras filtradas

TX114 fraccionamiento
Membranas encubadas con TBS
(1% / 4C)
Separacin por electroforesis 11.5%
poliacrilamida
Analisis por westernblot
Observadas con azul de Coomasie

Metodos analticos

Preparacin de bacterina

Proteinas totales por Bradford

Actividad de ATPpasa

Cultivadas en medio Hyfics 37C

Recolectadas y resusupendidas en
buffer TN
Inactivadas con INA y UV /
Paraformaldeido 1-4x10 8 UFC
Uso de Adjuvante de Freund +
tratamiento ultrasnica 1 min 4C /
200w al 50%
Prueba de esterilidad y lamacenaje
a 4C

Materiales y mtodos
Valoracin de la respuesta inmune a MG-INA
bacterina

Pollos

Separados en grupos

Desangrados

Celdas con presin negativa (8

semanas)
Muestras de sangre vivos sin
anestecia sacrificados CO2
Desangrados prueba en
suero libres de Mycoplasma

Grupo I: MG-INA
Grupo II: MG-PFA :
Grupo III: Adjuvante + buffer
TN

Prueba de anticuerpos para

INA y PFA
Muestras del paladar PCR
Libre de M. gallisepticum

Resultados y discusin
Efecto de UV + IODOAZIDONAPFTALENOS en
la viabilidad de Mg

4min Decenso de 2 3 log en la viabilidad Ms efectivo

 INA AzNAP y UV por 2 min

 Probar habilidad de invader cRBCs

A Sin tartar: Focs de fluorescencia en superficie e intracelulares
MICOPLASMA
B Tratado> Poca fluorescencia

 Examinar cambios en la integridad structural

a 37C: lisis, poco contenido citoplasmatico
A 4C: similar a las no tratadas

 Probar integridad funcional de la membrana

Actividad enzimatica del Sistema de transporte de arginina
Inactivacion de ATPasa

Sin tratar

Efecto en las
actividades de
trasnporte :
Absorcion de L arginia
Tratadas con INA

 Efecto en las proteinas de

membrana y lipidos
Movilidad en las proteinas de
mayor tamao no cambia.
Movilidad en las de menor
tamao cambia
Lipoproteinas Intensidad y
bandas similares

Discusin

Uso de la bicapa lipdica para la inactivacin de Mycoplasma y

desarrollo de vacunas
Iodoazidonaftalenos y UV disminuyeron la viabilidad de M.
gallisepticum
Estudios confocales muestran la no invacion a cRBCs
TEM Muestras que muchas de las celulas tratadas son similares
estructuralmente a las no tratadas
Celulas tratadas retienen lipoproteinas de superficie , solo se afecta
a las proteinas integrals embebidas en la bicapa
Lipoproteinas de Mycoplasma son proinflamatorias activando
respuesta innata y adaptativa