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BIOQUIMICAS Y BIOTECNOLOGICAS
PROGRAMA PROFESIONAL DE INGENIERIA
BIOTECNOLOGICA
DOCENTE:
Ing. EDILBERTO MEDINA
CROMATOGRAF
DE
A
INICO
INTERCAMBIO
INTRODUCCION
La cromatografa es :
Un mtodo usado principalmente
para
la
separacin
de
los
componentes de una muestra, en el
cual
los
componentes
son
distribuidos entre dos fases:
Estacionaria
Mvil
Las retenciones pueden tener su
origen
en
dos
fenmenos
de
interaccin entre las dos fases:
Adsorcin
Absorcin
Funciones:
Separar los
componentes de la
mezcla.
Medir las proporciones
de los componentes.
Tipos:
Cromatografa plana
Cromatografa en
columna
CROMATOGRAFA DE
INTERCAMBIO INICO
Mtodo de separacin que permite la
separacin de molculas basada en sus
propiedades de carga elctrica.
Fase Estacionaria: Insoluble, lleva en la
superficie cargas electrostticas fijas que
retienen contraiones mviles que pueden
intercambiarse por iones de la fase mvil.
Fase Mvil: Disolucin acuosa con
cantidades moderadas de metanol u otro
disolvente orgnico miscible con agua que
contiene
especies
inicas
en
forma,
generalmente de buffer. Los iones de la fase
mvil compiten con los analitos por los sitios
activos de la fase estacionaria.
PROPIEDADES DE LOS
INTERCAMBIADORES
Intercambiador Inico: Polmero que
tiene grupos cargados unidos.
Intercambiador Catinico: Si un grupo est
cargado
negativamente,
podr
intercambiar iones positivos.
Un grupo tpico que se utiliza en los
intercambiadores de cationes es el grupo
sulfnico, SO3-. El grupo cido sulfnico es
un
intercambiador
de
cationes
fuertemente acido. Otros grupos de
utilizacin corriente son el carbonilo e
hidroxilo fenlico, dos intercambiadores
catinicos dbilmente cidos.
Intercambiador Aninico: Si el
grupo cargado es positivo, es un
intercambiador de aniones. Los
intercambiadores
aninicos
dbilmente bsicos ms corrientes
son grupos aminos alifticos o
aromticos.
MATERIALES
(1) Columna de vidrio
(2) Matriz de
intercambio inico
(Resina)
(3) Eluyente
(4) Muestra a
fraccionar
(5) Colectores.
PROCEDIMIENTO
Equilibrio: Toda la fase estacionaria se encuentra
asociada a iones complementarios (que pueden ser
cloro o sodio).
PROCEDIMIENTO
ADSORCIN
/DESORCIN
ADSORCIN
-La fuerza de adsorcin
aumenta con el aumento
de carga neta.
DESORCIN
-Reducir
la
carga
neta
cambiando el pH
-Agregar un in que compita
por
las
cargas
del
intercambiador.
GRADIENTE DE NaCl
(A)
(B)
(C)
(D)
(E)
VENTAJAS
/DESVENTAJAS
Ventajas:
Alta capacidad
Alta resolucin
Paso concentrador: Se puede sembrar un gran
volumen para luego eluirlo en un menor volumen.
Con una misma columna se puede utilizar a
diferentes pH y obtener diversos perfiles de
elucin.
Desventajas:
Las muestras deben estar desalinizadas antes de ser
aplicadas a este tipo de cromatografa
TIEMPO DE
RETENCIN
pH
Los intercambiadores inicos se
clasifican en cidos o bsicos, fuertes
o dbiles.
Las resinas cidas fuertes siguen
ionizadas incluso en disoluciones muy
cidas, en cambio las resinas cidas
dbiles se protonan a un pH prximo a
4 y pierden su capacidad de
intercambio catinico, reducindose
as, el tiempo de retencin.
Los grupos muy bsicos de amonio
cuaternario siguen siendo catinicos a
cualquier valor de pH. Los bsicos
dbiles de amonio terciario se
desprotonan
en
disoluciones
CARGAS
CARGAS
GRADIENTE
Aumentando la
concentracin de
la fase mvil, los
iones
compiten
cada vez ms
favorablemente
con la muestra
por
los
sitios
activos cargados
de
la
fase
estacionaria.
POROSIDAD
poro pequeo
(menor de 600)
poro grande
(mayor de
600)
SUPRESORES
DE IONES
La conductividad de la fase
mvil se hace muy elevada
debido a la alta concentracin
inica necesaria para eluir a la
mayora de los iones; esto hace
muy difcil la deteccin de
pequeas concentraciones de
analito.
Este problema se resolvi
mediante un sistema supresor de
conductibilidad colocado a la
salida
de
la
columna
cromatogrfica.
Los primeros supresores fueron
columnas de intercambio inico
CROMATOGRAMA
El cromatograma es el
resultado grfico de la
cromatografa. En el caso
de separacin ptima, los
diferentes
picos
o
manchas
del
cromatograma
se
corresponden
a
los
componentes de la mezcla
separada.
La posicin de los
mximos nos indica el in
presente
(carcter
CROMATGRAFO
Una
vez
separada,
la
muestra pasa a travs del
detector donde se registra la
seal obtenida respecto al
tiempo de retencin.
Registran
cromatogramas.
los
Se
emplean
en
la
determinacin de fluoruros,
cloruros, nitritos, nitratos,
bromuros fosfatos y sulfatos.
APLICACIONES
MEDICIN DE LA
HEMOGLOBINA
GLICOSILADA.
DETERMINACIN DE
PBG Y ALA EN LA
ORINA.
HEMOGLOBINA
GLICOSILADA
El porcentaje de protena unida a la
glucosa es lo que se denomina
hemoglobina glicosilada (HbA1).
Cuanto mayor es la cantidad de
glucosa en la sangre, ms se une a
las protenas y su porcentaje de
unin indica cual ha sido la cantidad
media de glucosa circulante durante
el
tiempo
de
vida
de
la
hemoglobina.
Como los eritrocitos son fcilmente
permeables a la glucosa, el nivel de
la HbA1 en una muestra de sangre
facilita la historia glicmica de los
HEMOGLOBINA
GLICOSILADA
HbA1c
(%)
Calificacin
5-6
Promedio de
Glicemias
(mg/dl)
80-120
6-7
120-150
Muy Bueno
7-8
150-180
Bueno
8-9
180-210
Regular
9-10
210-240
Problemtico
10-11
240-270
Malo
11-12
270-300
Muy Malo
Excelente
HEMOGLOBINA
GLICOSILADA
HEMOGLOBINA
GLICOSILADA
OTRAS
APLICACIONES
CONCLUSIONES
Extraccin y purificacin de cidos nucleicos
Purificacin de agua
Purificacin del fibringeno de la leche
Determinacin de anticonvulsantes en el
suero despus de la extraccin de la fase
slida.
Anlisis de antibiticos de politer
Determinacin de pesticidas.
Identificacin de cidos orgnicos en la fruta y
en el jugo.
Deteccin de derivacin-fluorescencia postcolumna para anlisis para varios tipos de
pesticidas agrcolas .
Determinacin de metabolitos de Triptofan en
el suero umbilical.