Ingeniera Metablica de

Escherichia coli : Incremento de

NADH disponible por
sobreexpresin de NAD+dependiente de Formato
deshidrogenasa

NAD+ juega un rol central en el metabolismo celular como

cofactor en reacciones REDOX

NADH/NAD+ tiene un efecto regulador en la expresin de genes y

en actividad de enzimas.
Principal reaccin: oxidacin de fuentes de carbono
Expresin del gen adhE que codifica la alcohol deshidrogenasa.
En altas concentraciones inhibe la piruvato deshidrogenasa
Reduccin u oxidacin de L-lactaldehdo

 Mtodos de estudio:
Alternando distintas
fuentes de carbono con
distintos estados de
oxidacin
Adicionando distintos
aceptores de electrones
(Fumarato, nitrato)
Expresando una enzima
(NADH oxidasa)
Adiccin de electrones
portadores de tinte
Variacin de condiciones
del potencial de oxidoreduccin
****El principal problema reside en que la enzima de inters compite con otras que tambin lo requieren, as como la forma
requerida (oxidada o reducida)

NAD+-Formato deshidrogenasa
dependiente
Se obtiene de levaduras metilotrficas y bacterias
Cataliza la oxidacin del Formato a CO2 y la reduccin de NAD+ a
NADH

Porque regenerar cofactores?

Para la produccin de aminocidos, hidroxicidos
activos, esteres, alcoholes, y dems productos
sintetizados mediante deshidrogenasas
Estrategia: Sobre-expresar de forma
biolgicamente active NAD+ dependiente de
formato deshidrogenasa (FDH) de Candida
boidinii en Escherichia coli

Cepa
BS1
Se reemplaz el gen original
fdhF por la fusin fdhF-lacZ

Transduccin mediada por

fagos P1vir con E. coli M9s
como donador y E. coli GJT001
como receptora

Cepas original y GJT001

transducida fueron cultivadas
en placas de un medio mnimo
de glucosa durante 2 das en
una cmara anaerbica bajo
condiciones atmosfricas de Y

La actividad formato
deshidrogenasa fue evidenciada
por el cambio de coloracin de la
cepa original a un tono prpura.
Las colonias transductantes
permanecieron blancas, lo que
indicaba la falta de dicha
actividad

Por PCR se identific la presencia

del mutante fdhF en
transductantes. Los cebadores
complementarios a los extremos
del gen fdhF fueron usados para
amplificar el gen en ambas
cepas, la original y la GJT001
transducida.

Se confirm la interrupcin del

gen fdhF de la cepa transducida
por la ausencia de un producto
de la PCR en contraste con el
producto de 2.2-kb
correspondiente al gen completo
de la cepa original

Experimentos con pFDH1 no

mostraron actividad FDH,
sugiriendo que el gen no se
expres adecuadamente en E.
coli. El gen de C. dodinii fue
amplificado por PCR y puesto
bajo control por el promotor lac
para sobreexpresar en E. coli

El gen de C. dodinii fue

amplificado por PCR y puesto
bajo control por el promotor lac
para sobreexpresar en E. coli;
para ello se us el kit GeneAmp
XL PCR por la habilidad de
lectura de la rTth DNA
polimerasa y correccin de
nucletidos mal incorporados

Plsmi
do
pSBF2
Plsmido pFDH1 contiene inserto
de EcoRI 3 kb con el gen fdh1
delevadura C. boidinii que est
bajo control de su promotor
nativo

Los sitios EcoRI y BamHI fueron

usados como primers de avance y
reversa, respectivamente.

pUCFDH y pDHK30 fueron

digeridos con EcoRI/XbaI y
ligados para obtener el
plsmido pSBF2. Este
producto fue transformado en
DH10B y colonias blancas de
las placas Km/Xgal

El producto final fue verificado por

electroforesis en agarosa y
purificado para luego ser diferido
con EcoRI y BamHI. Esta digestin
tambin se realiz con el vector
pVC18. Los ligamientos anteriores
formaron pUCFDH

pUCFDH fue transformado en la

cepa DH10B. Este mismo plsmidos
sirvi como vector intermediario del
gen fdh y pDHK30 por tener un
gran nmero de copias del
plsmido con resistencia a
kanamicina y no interferir con
resistencia a ampicilina de la cepa
BS1.

Fueron analizadas por

electroforesis en agarosa
despus de la digestin con
EcoRI/XbaI

Se seleccion un plsmido
apropiado para ser
transformado en GJT001 y la
cepa BS1. Como
controladores negativos:
GJT001 fue transformado con
pDHK29 y BS1 con pDHK30

Se centrifug 20 ml de cultivo
(4,000 g; 4C; 10 min) y suspendi
en 10 ml de buffer sodio fosfato (pH
7.5 con 0.1 M -mercaptoetanol)
para centrifugar de nuevo. Luego se
resuspendieron las clulas en 10 ml
de buffer y se sonicaron (6 min)

Las clulas se centrifugaron (1,500

g; 4C; 60 min) para remover
escombros celulares y reducir NAD.

Ensayo de
actividad FDH
Se hicieron crecer los cultivos
durante la noche en medio LB
suplementado con 20 g/L glucosa y
100 mg/L de kanamicina en
condiciones anaerbicas. Fueron
inoculados con 100 ul de 5ml del
cultivo LB para hacerlos crecer en
agitador (37 C; 250 rpm)

La actividad del formato

deshidrogenasa se ensay a
30C adicionando 100 ul de
extracto celular a 1ml de
reaccin mezcla (1.67 mM , 167
mM formato de sodio y 100 mM
-mercaptoetanol) en buffer
fosfato (pH 7.5)

Se fue midiendo el incremento

de la absorbancia de NADH a
340 nm

Se tomo como la unidad

cantidad de enzima que produce
1 umol de NADH por minuto a
30C. La concentracin total de
protena se determin con el
mtodo de Lowry.

Experimento de
crecimiento
Las cepas GJT001 (pDHK29) y
BS1 (pSBF2) se hicieron crecer
en cultivos por triplicado en
condicin aerbica en agitador
rotatorio (37C; 250 rpm).

Crecieron en frascos agitados

de 250 ml conteniendo 50 ml
de medio LB suplementado
con 10 g/L glucosa, 100 mg(L
kanamicina, y 0 o 100 mM
formato.

La demanda de oxgeno a 600

nm fue medida cada 30 min
durante la fase de crecimiento
exponencial.

Tambin se adicion 1 g/L para

reducir el tiempo lag que ocurre en
condiciones anaerbicas. Los
cultivos fueron inoculados con 100
ul de 5 ml LB. Despus, 6ml de aire
fueron removidos con jeringuilla.

Se crecieron los cultivos en agitador

rotatorio (37C; 250 rpm). Una
muestra del medio inicial se guard
para su anlisis , y las muestras
fueron retiradas con una jeringuilla
a intervalos de 24 horas.

Experimentos con tubos

anaerbicos
Se usaron frascos de vidrio de 4045 ml con abre-tapas superiores y
PTFE/septo de silicona y caucho. A
cada uno se le puso 35 ml (frasco
de 40 ml) o 40 ml (frasco de 45 ml)
de medio LB suplementado (20 g/L
glucosa, 100 mg/L kanamicina, 0 o
50 mM formato).

Experimentos con frascos

agitados aerbicos
Los cultivos por triplicado se
hicieron crecer en condiciones
aerbicas usando frascos
agitados de 125 ml conteniendo
25 ml medio LB o frascos de 250
ml conteniendo 50 ml medio LB.

El medio LB fue suplementado

con 10 g/L glucosa, 100 mg/L
kanamicina, y diferentes
cantidades de formato. Los
cultivos fueron inoculados con
50 o 100 ul de los 5 ml cultivo
LB y crecieron en agitador
rotatorio (37C; 250 rpm)

Una muestra del medio inicial

fue guardado para analizar
mediante HPLC y las muestras
fueron tomadas despus de 24
horas de crecimiento.

Los productos de la fermentacin

as como la glucosa fueron
cuantificados usando HPLC
equipado con una columna de
intercambio catinico y un detector
diferencial refractivo.

La fase mvil de 2.5 mM a 0.6

ml/min rango de flujo fue usado y la
columna se oper a 55C.

Tcnicas
analticas
La densidad celular fue medida a
600 nm en espectrofotmetro. Las
muestras de fermentacin fueron
centrifugadas durante 5 min en
microcentrfuga. El sobrenadante
fue filtrado a travs de una
jeringuilla de 0.45 um y
almacenada en refrigeracin para
HPLC

Experimentos en tubos anaerbicos: sobreexpresin de

FDH dependiente de NADH y adicion de formiato

Experimento aerbico Shake

Flask

Investigar
Investigar el
el efecto
efecto de
de
aumento
aumento de
de la
la disponibilidad
disponibilidad
intracelular
intracelular de
de NADH
NADH
sustituyendo
sustituyendo el
el FDH
FDH nativo
nativo
por
por NAD+
NAD+

Se
Se realizaron
realizaron con
con y
y sin
sin formiato
formiato
(100mM)
(100mM)
+
+
Formiato
como
Formiato como sustrato
sustrato para
para la
la
nueva
nueva FDH
FDH durante
durante el
el crecimiento
crecimiento
aerbico
aerbico

El consumo de glucosa aument en un 50% y la densidad celular fue la ms alta

BS1 (pSBF2)

GJT00(pDHKL29)

La adicin de formiato a los cultivo aerbicos causo un 50% de consumo de glucosa, la

densidad celular aumento en un 48%.
El consumo de glucosa fue similar par ambas cepas, mientras que la densidad celular fue
ms alta para BS1

En BS1 (pSBF2)
LaAumenta
adicin de
de etanol,
lactato
y succinato
(metabolitos
36formiato
veces el induce
etanol,la
7 produccin
veces en succinato
y la
aparicin
de lactato,
los nivelesque
de
solo
se producen
en condiciones
acetato
aumentan
en un 11% yanaerobias
la relacin Et/Ac se incrementa 32 veces

En GJT001 (pDHK29)
El aumento en los niveles de acetato fue mayor (46%) con formiato suplementado, la
produccin de etanol fue mucho ms bajo 5.15 mM despus de 24h. Los niveles de succinato
aumentaron pero no en comparacin con 7 veces el de BS1

 Es posible aumentar la disponibilidad de NADH intracelular a

travs de la sustitucin por FDH nativa de E. coli por una
NAD+ dependiente de FDH.
Los niveles ms altos de NADH proporcionan un entorno
reducido incluso bajo condiciones aerbicas.
Las clulas utilizan NAD extra para reducir intermediarios
metablicos que conducen a la formacin de productos de
fermentacin con el fin de lograr un equilibrio redox.
La nueva ruta FDH es mucho ms eficaz por que retoma el
poder reductor directamente como NADH.

Efecto de suplantar diferentes

niveles de formiato en cultivos BS1
(pSBF2)

Lactato

Estaba ausente en 0 y 50 mM
pero se produjo a los 100, 150
y 200 mM, la [ ] de lactato
aumento con el aumento de
formiato inicial

Succinato

Misma tendencia , solo que se

produjeron en 0 y 50 mM

Etanol

No aumenta
significativamente con los
niveles de formiato

DO

No siguen ninguna tendencia

notable

Consumo
de Glu.

Aumento con la adicin de

formiato pero, ya que toda la
glu fue consumida x 24 horas,
el efecto de dif. niveles de
formiato no pudo
determinarse.

Dat
os
no
se
mu
est
ran

 Las [ ] residual de formiato alcanzo 63.5 mM para 200 mM Las

clulas estn posiblemente utilizando el NADH formado por la
generacin de ATP a travs del sistema de transporte de electrones
(aerbicamente).
Los dif. Niveles de formiato se pueden utilizar para proporcionar dif.
Niveles de reduccin de la potencia
Niveles ms altos de reduccin de energa aerbica aumento la
produccin de lactato.
Los cultivos aerbicos sin suplementacin de formiato (amb.
reducido) la produccin de etanol aumento altamente, mientras que
disminuyeron los niveles de lactato. Sin embargo la suplementacin
de formiato en cultivos aerbicos provocan aumentos en los niveles
de lactato, lo cual fue consistente con el caso aerbico.

Conclusin
Es posible aumentar la disponibilidad de NADH a travs de
ingeniera metablica.
En condiciones anerbicas, el NADH disponible aument de
2 a 4 moles NADH / mol glucosa consumida favoreciendo la
produccin metabolitos reducidos.
La adicin de formiato a BS1 (pSBF2) a cultivos aerbico
inducen la produccin de etanol, lactato, y succinato,
metabolitos que son normalmente producidos solamente en
condiciones anaerbicas.