Ingeniera en biotecnologa

Bioqumica microbiana
Profesor:
Julio Armando Alpuche Prez
Integrantes:
Edn Len Prez
Miguel ngel Dzib Miss
Adalberto Zetina Ayala
Julio Cesar Rodrguez lvarez
Grupo: IB4B
10 de septiembre del 2015

Fundamentos de la cintica
enzimtica

CINETICA QUIMICA
Cintica Qumica es aquella parte de la Qumica que se
encarga de estudiar la velocidad de una Reaccin Qumica y
los factores que permiten su control.
Se limita a :
a) Reacciones Reversibles

CLASIFICACION DE LA REACCIONES QUIMICAS

* Segn el nmero de molculas:

A

A+B

A+B+C

SEGN EL NMERO DE REACCIN

R. Primer Orden: A

V= -d A= K (A)
dT
R. Segundo Orden: A+ B
V= -dA = -dB + dP
dT
dT dT
V= K (A) (B)

CINETICA DE MICHAELIS-MENTEN
En 1913 Michaelis y Menten de Hill propusieron una
teria para explicar la velocidad inicial de una reaccin
catalizada por una
enzima, en funcin a la
concentracin del sustrato.
La concentracin de sustrato que produce la mitad de la
velocidad mxima, llamada valor Km o Constante de
Michaelis, se puede determinar experimentalmente
graficando v1(velocidad inicial) como funcin de [S].
La expresin de Michaelis-Menten
Vo = Vmax [S]
Km + [S]

M.M.en 1913 investigaron el siguiente sistema :

Sacarosa

invertasa

Glucosa + Fructosa

agua

Midieron la velocidad inicial Vo en condiciones

experimentales
a)(E) variable y (S) constante
b)(E) constante y (S) variable

A) Efecto de la (E) sobre la velocidad Enzimtica

Vo

)
E
(
&

Vo

(E)

B) Efecto de la concentracin del sustrato

sobre la velocidad de una reaccin

-------------------------------------------------------

Vo

1/2 Vmax

KM

Sustrato (S)

Se supone:
E+ S
ES
KM

ES
E+P

= Constante de Michaelis -Menten

Constante global que sustituye o engloba las constantes de

velocidad de la reaccin de interaccin entre el enzima y
el sustrato
Vo = Velocidad inicial de reaccin
Vmax = Cuando el enzima se halla saturado

Como se relacionan Vmax, Km y Vo?

Observemos : *

K1

E + S

K3
ES

E+P

K2
K4

Que hay un solo sustrato

Que la velocidad K4 se desprecia
* Que la concentracin del E es muy pequea
* Que la E puede estar como: E libre y ES
* Que el equilibrio alcanzado por K1 es ms rpido que

K3, por lo que ste es limitante determina, o

limita, la cantidad de producto formado

POR LO QUE...

*LA FORMACION DEL PRODUCTO SERA:

*VO = K 3(ES)
*LA ECUACION RESULTANTE SERA:
*

VO =Vmax.(S)

*
(S) + Km
Ecuac. Michaelis
Menten

La dependencia de la velocidad inicial de una reaccin catalizada

por enzima en [S] y en Km puede aclararse valorando la ecuacin
de Michaelis-Menten como sigue:
1) Cuando [S] es igual que Km:
vo= Vmax*[S]
Km + [S]

vo = Vmax*[S] = Vmax[S] = Vmax

[S]+ [S]
2[S]
2

2) Km= K2 + K3/
K1
Si K2>> K3
K m= (E) (S)
(ES)

Km =K2/K1
K = (E) (S)
ES)

* SIGNIFICADO E LA VELOCIDAD MAXIMA

* Vmax= K3 (ET)
* # de recambio
* K3= nmero de molculas de Sustrato convertidas en producto por
unidad de tiempo, cuando la enzima esta saturada

NMERO DE RECAMBIO
Carboxipeptidasa

102

Tripsina

102 a 103

Cinasas
Deshidrogenasas
Transaminasas
Anhidrasa carbonica
Superoxido dismutasa

103
103
103
106
106

catalasa

107

DETERMINACIN DE KM Y Vmax MEDIANTE UNA

ECUACION LINEAL
Se tiene:
vo= Vmax*[S]
Km + [S]
Se factoriza 1 =
vo
Se simplifica:

1=
vo

se invierte 1 = Km + [S]
vo Vmax*[S]

Km
* 1 +
[S]
Vmax
[S]
Vmax[S]

Km * 1 +
1
Vmax [S]
Vmax

La ecuacin de la recta es:

y=a*x+b

La ecuacin de la recta es:

y=a*x+b
donde:

y = 1
Vo

x =

1
[S]

El valor de Km puede ser hallado a partir de la

grfica de Lineweaver-Burk o del doble reciproco
usando la pendiente y la interseccin negativa de x.

Representacin recproca doble

(Lineweaver - Burk)

y=a*x+b

0.04

1/v
0.03

1/Vmax
-1/Km

0.02

1
K m 1
1

v V mx s V mx

0.01

0.00
-0.4

-0.2

0.0

0.2

0.4

0.6

1/s

* INHIBICION ENZIMATICA
*ENTENDEMOS

COMO EL EFECTO DE ALGUNAS

SUSTANCIAS SOBRE LA VELOCIDAD CATALITICA DEL
ENZIMA

*APLICAMOS

LA ECUACION DE LINENWEAVER-BURKE EN
LA IDENTIFICACION DEL TIPO DE INHIBICION.

Por qu determinar Km?

Km es una medida de la afinidad de la enzima por el sustrato
cuando k3<k2. Km=(k 2+k3)/k1
Km establece un valor aprox. para el valor intracelular de sustrato
Km es constante para una enzima dada, permite comparar enzimas
de diferentes organismos o tejidos o entre distintas protenas
Un cambio en el valor de Km es un modo de regular la enzima

Kcat/ Km es una medida de la eficiencia cataltica

K3 = k cat Vmax = Kcat Et
Kcat=Vmax/Et Nmero de recambio

INHIIBIDORES

1. Inhibidor reversible: establece un equilibrio con la enzima

libre, con el complejo enzima-substrato o con ambos:
E+I

EI

ES + I

ESI

2. Inhibidor irreversible: modifica qumicamente a la

enzima:
E+I
E

INHIBICIN REVERSIBLE
(a) El inhibidor se fija al centro activo de la enzima libre,
IMPIDIENDO LA FIJACIN DEL SUBSTRATO:
Inhibicin Competitiva
(b) El inhibidor se fija a la enzima independientemente de
que lo haga o no el substrato; el inhibidor, por tanto, NO
IMPIDE LA FIJACIN DEL SUBSTRATO a la enzima,
pero s impide la accin cataltica: Inhibicin No
Competitiva

Inhibicin Competitiva

S
E

ES

E+P

I
EI

Se define una constante de

equilibrio de disociacin del
inhibidor:

[E] [I]
Ki =
[EI]

Caractersticas:
- Las fijaciones de substrato e inhibidor son mutuamente exclusivas
- A muy altas concentraciones de substrato desaparece la inhibicin
- Por lo general, el inhibidor competitivo es un anlogo qumico del
substrato.
- El inhibidor es tan especfico como el substrato

En condiciones de equilibrio rpido, llamando y a la concentracin

del complejo EI, para la inhibicin competitiva obtenemos el sistema de ecuaciones

(e0 x y )s
K m
x
(e0 x y )i
Ki
y
Que resuelto para x nos da

e0s

i
Km 1
Ki

De donde

s
v

i
Km 1
s
Ki

m x

Por tanto, en la inhibicin competitiva,

1. El efecto cintico del inhibidor es el aumento aparente de la

Km, que aparece multiplicada por el factor (1 + i/Ki)
2. La Vmax no aparece modificada; para concentraciones muy
altas del substrato, v = Vmax, igual que en ausencia de inhibidor
3. Cuanto ms pequeo sea el valor de Ki mayor ser la potencia
del inhibidor competitivo.

Representacin directa
Inhibicin competitiva

120

100

80

60

40

20

0
0

20

40

60

80

100

120

Inhibicin competitiva - Representacin recproca doble

1/v

0.07
0.06

1/Vmax

0.05
0.04

-1/Km

0.03
0.02
0.01

1/s

0.00
-0.3

-0.2

-0.1

0.0

0.1

0.2

-1/(Km(1 + i/Ki))

0.3

0.4

0.5

0.6

Inhibidores
competitivos

Succinato deshidrogenasa
COO-

FAD

FADH2

COO-

CH2

CH

CH2

CH

COOSuccinato

SDH

COOCH2
COOMalonato

COO-

COO-

Fumarato

C O
CH2
COOOxalacetato

COOInhibidores competitivos
como nalogos estructurales
del substrato

CH2
CH2
COOSuccinato
COOC O
CH2
COO-

Oxalacetato

Inhibicin No Competitiva

S
I

E
S
EI

ES

E+P

ESI

El inhibidor se fija indistintamente a la enzima libre E

y al complejo enzima-substrato ES; ni el complejo EI
ni el complejo ESI son productivos

* INHIBICION NO COMPETITIVA
*E + I
*I

+ ES

EI
ESI

*El agente quelante EDTA se une reversiblemente

al Mg2+ y a otros cationes divalentes, e inhibe as
de modo no competitivo a algunas enzimas que
precisan esos iones para su actividad.

DROGA

USO
TERAPEUTICO

ENZIMA
AFECTADA

TIPO DE
INHIBICION

Lovastina

Hipercolestero
lemia

HMGCoA
reductasa

Competitiva

5fluoroacil

cancer

Dihidrofolato
reductasa

competitiva

alopurinol

gota

Xantino
oxidasa

irreversible

cumadin

anticoagulante

Glutamilcar
boxilasa

competitiva

captopril

hipertensin

ECA

competitiva

concepto de Anlogo de Estado de Transicin (AET)

- El inhibidor no es estrictamente anlogo del substrato,

sino del Estado de Transicin de la reaccin.
- La afinidad de las enzimas por los AET es enorme, del
orden nM o pM, con lo que la fijacin es tan fuerte que
puede considerarse irreversible

Estado de
transicin
Substrato

Anlogo de
estado de transicin

EN EL ESTADO DE TRANSICIN LAS INTERACCIONES ENTRE LA

ENZIMA Y EL SUSTRATO SON PTIMAS

INHIBICIN IRREVERSIBLE
- Los inhibidores irreversibles reaccionan con un grupo
qumico de la enzima, modificndola covalentemente

E+I

- El efecto de los inhibidores irreversibles depende del

- tiempo de actuacin del inhibidor.
- Los inhibidores irreversibles son, por lo general, altamente
txicos.

Algunos tipos de inhibidores irreversibles

1. Reactivos de grupos -SH

2. Organofosfricos
3. Ligandos de metales
4. Metales pesados

Reactivos de grupos -SH,

(a) Agentes alquilantes
Yodoacetato

ICH2 COO-

SH

IH

S CH2 COO-

(b) Compuestos insaturados

E

SH
O

N CH2 CH3
O

N CH2 CH3

N-Etil maleimida (NEM)

O

Reactivos de grupos -SH, 2

(c) Formadores de mercptidos
HOHg

SH

COO-

p-Hidroximercuribenzoato

S Hg

COO-

(d) Oxidantes
Promueven la oxidacin de dos tioles a un disulfuro

Organofosfricos
Ser CH CH2

H3 C

OH

Ser CH CH2
H3 C

CH3
CH

P O

CH
H3 C
CH3

DFP:
diisopropil
fluorofosfato

CH3
CH

O P O
CH
H3 C
CH3

- Actan sobre enzimas sernicas

- nicamente sobre la Ser activa
- Insecticidas: Parathion, Malathion
- Inhibidores de la Acetilcolinesterasa

Ligandos de coordinacin de metales

Es el caso del ion cianuro, CNSe fija con gran afinidad a la sexta posicin de coordinacin
del Fe hemnico, impidiendo toda modificacin posterior.
Por ello acta sobre sistemas de Fe hemnico con la sexta
posicin de coordinacin libre, como la citocromo oxidasa,
de lo que deriva su elevadsima toxicidad

SUBSTRATOS SUICIDAS
(Inhibidores activados enzimticamente)
- Se trata de molculas que se unen al centro activo de manera
especfica, igual que el substrato o los inhibidores competitivos
- Una vez unidos al centro activo, la enzima transforma la
molcula en una especie qumica muy reactiva que modifica
covalentemente a la enzima, inactivndola
- Tienen por tanto :
(a) la especificidad del inhibidor competitivo y
(b) la potencia de los inhibidores irreversibles

Modo de accin de los inhibidores suicidas

E+I

EI

EI*

E + I*

1. El inhibidor se fija a la enzima igual que el substrato o un

inhibidor competitivo convencional
2. La accin cataltica de la enzima convierte al inhibidor I
en una especie altamente reactiva I*
3. I* modifica covalentemente a la enzima, inactivndola
de forma definitiva al igual que un inhibidor irreversible.

INHIBIDORES SUICIDAS,
- SISTEMA DE LA -LACTAMASA BACTERIANA
La utilizacin masiva de antibiticos -lactmicos (penicilinas,
sus derivados semisintticos y cefalosporinas) ha conducido a
la aparicin de resistencias a los mismos.
Los microorganismos resistentes a estos antibiticos lo son por
producir una enzima, la -lactamasa, que inactiva a los antibiticos -lactmicos.

Penicilina (activa)
S

R CO NH

CH3
CH3

N
O

COO-

-Lactamasa

R CO NH
O C HN
O-

CH3
CH3

COO-

c.peniciloico (inactivo)

Muy a menudo los preparados de penicilinas o penicilinas

semisintticas se formulan aadiendo un inhibidor suicida
de la -lactamasa, el cido clavulnico
O
C

N
O

CH2OH
H

COO

-Lactamasa

HN

CH2OH
H

COO-

C
O

C
O-

c.clavulnico

CH CH2
Ser

HN

CH2OH
H

COO-

Esta molcula
reacciona con la
serina activa de la
-lactamasa,
produciendo su
inactivacin

- SISTEMA DE LA MONOAMINO OXIDASA (MAO) CEREBRAL

Los estados depresivos, en general, estn relacionados con un
descenso en la concentracin de neurotransmisores adrenrgicos
(dopamina, noradrenalina, etc.) en determinadas regiones del
cerebro.
Una de las enzimas encargadas de la degradacin de estos
neurotransmisores es la monoamino oxidasa (EC 1.4.3.4).
Por tanto, la inhibicin de la monoamino oxidasa se emplea como
teraputica de los estados depresivos. Se han desarrollado muchos
inhibidores suicidas de la MAO

HO
HO

Noradrenalina
CHOH CH2 NH2

O2 + H2O

Monoamino
oxidasa
NH3 + H2O2
HO
HO

CHOH CHO

Dihidroxifenilglicol

La MAO es una flavoprotena:

tiene un grupo prosttico
flavnico (FAD) fundamental
para la catlisis. Los inhibidores
suicidas de la MAO inactivan
al cofactor FAD.

O
H 3C

E S H 2C

N,N dimetil
propargilamina
(pargilina)

NH
N

Flavina

HC C CH N

CH3

H3C

Inhibicin suicida de la
MAO mediante Pargilina

CH3

N+

CH CH

H3C

CH

H 3C

E S H 2C

Flavina modificada

O
NH
NH

CINETICA DE REACCIONES BIMOLECULARES

1 )Reaccion Secuencial o de Desplazamiento Simple
Azahar:

A +E

AE

AE+B

AEB

B+ E
BE + A

BE
BEA

2) ORDENADA

MALATO + NAD
OXALACETATO + NADH.

E-NAD-MALATO
1
2

M.D

2) REACCION DE DOBLE DESPLAZAMIENTO

ASPARTATO + OXOGLUTARATO
OXALACETATO + GLUTAMATO
1) Aspartato + PLP-E
2) Oxoglutarato + NH3

NH3- PLP-E + Oxalacetato

PLP-E + Glutamato

qu son las molculas

efectoras o moduladoras ?
Son molculas que pueden ser
activadores (+) o inhibidores (-) de la
velocidad cataltica.
No cambian la afinidad del enzima
por el sustrato.
Pueden ser el mismo sustrato
denominado HOMOTROPICO o es
otra sustancia al que se le conoce
como HETEROTROPICO

Moduladores positivos
Moduladores negativos

ES DIFERENTE A LAS
S?
A
T
IS
V
S
E
T
N
A
S
A
IM
Z
N
E

SI!!
PORQUE LOS E.A. PRESENTAN 2
LOCALIZACIONES DE UNION DE
LIGANDOS:

1.- Las catalticas (Centro Activo) a las

que se une el sustrato.
2.- Las reguladoras (Centro Alostrico)
a las que se unen las molculas
denominada efectores o moduladores.

ENZIMAS
ALOSTERICAS
S

EF

S
CA

EF

C.ALOST.

ENZIMA

La unin cooperativa de la
primera molcula de S o ligando
a la Enzima incrementa la
velocidad
de
unin
de
subsecuentes
molculas
de
sustrato a los otros sitios de
unin: cooperatividad positiva

*CINETICA SIGMOIDEA

ENZIMAS ALOSTERICAS

Enzimas
susceptibles de
ser modificadas
por molculas
pequeas.

* ESTADO CONFORMACIONAL

T
Baja afinidad por el sustrato

Alta afinidad por el sustrato

MODELOS DE INTERACCIONES ALOSTERICAS

MODELO CONCERTADO:
+S

RR
TT

RR

MODELO SECUENCIAL :

TT

+S

RT

+S

RR

Conclusiones.
La Cintica Qumica es aquella parte de la Qumica que se encarga de estudiar la
velocidad de una Reaccin.
La cintica enzimtica estudia la velocidad de las reacciones catalizadas
enzimticamente. Los principios generales de las reacciones qumicas se aplican
tambin a las reacciones enzimticas
Mediante la ecuacin de Michaelis-Menten se puede calcular la velocidad inicial
de una reaccin catalizada por una enzima, en funcin a la concentracin del
sustrato.
El valor de Km puede ser hallado a partir de la grfica de Lineweaver-Burk o del
doble reciproco usando la pendiente y la interseccin negativa de x.

Conclusiones.
Entendemos como inhibicin el efecto de algunas sustancias sobre la velocidad
cataltica de la enzima y para la identificacin del tipo de inhibicin aplicamos la
ecuacion de linenweaver-burke.
Existen inhibidores reversibles: establece un equilibrio con la enzima libre, con el
complejo enzima-substrato o con ambos e inhibidores irreversibles: modifica
qumicamente a la enzima.
Existen inhibidores suicidas el cual realiza la accin de :
(a) la especificidad del inhibidor competitivo y
(b) la potencia de los inhibidores irreversibles