USO Y CUIDADO DE COLUMNAS

CROMATOGRAFICAS (HPLC)

HPLC
Definicin de la Cromatografa
Teora Cromatogrfica
Divisiones de la Cromatografa
Columnas HPL-Uso-Seleccin-Cuidados

DEFINICION
Que es la Cromatografia?

La Cromatografa es una
Tcnica de separacin .

El
propsito
de
la
Cromatografa es Separar
y Cuantificar analitos en
mezcla (por lo general en
matrices complejas).

Se basa en la particin de
solutos entre dos fases: la
fase estacionaria y la fase
mvil.

Cmo es que ocurre la separacin en Cromatografia?

La separacin ocurre por
migracin de los analitos en
mezcla
a
diferentes
velocidades.
La velocidad de migracin esta
gobernada
por
diferentes
interacciones entre un Soluto
(conducido por un lquido en
movimiento) y el Absorbente
(slido o lquido).

Columnas
y
Fases
ta
Es cionarias

Solventes
para HPLC

Cmo es que ocurre la separacin en Cromatografia?

Fase
Estacionaria

Soporte

Fase
Mvil

La Fase Estacionaria.- Se empaca o

deposita en la columna.
Por lo general esta constituida por un
slido poroso, con un tamao de
partcula muy pequeo, de superficie
inerte. Este slido esta recubierto por
una pequea capa o pelcula de un
lquido.
La Fase Mvil.- Pasa a travs de la
columna a una velocidad determinada y
transporta la muestra.
Es un solvente de alto grado de pureza
o una mezcla de ellos.

Cmo es que ocurre la separacin en Cromatografia?

Fase Estacionaria

Analito A

Fase Mvil

Analito B

Representacin de una separacin Cromatogrfica

Cmo es que ocurre la separacin en Cromatografa?

La migracin depende de la solubilidad
de los solutos en fase estacionaria y
en fase mvil.
A)

Inyeccin

Migracin

Si el soluto es altamente soluble en

la fase mvil y poco soluble en la
fase estacionaria, entonces---------?

B)

Si el soluto es mas soluble en la fase

estacionaria, el compuesto migrar
entonces--------------------------------?

C) Si cada soluto viaja a travs de la

columna a una velocidad diferente,
entonces------------------------------?
= compuesto A
= compuesto B

Elucin

La Separacin Cromatogrfica
Cuando la muestra y la Fase Mvil atraviesan la
fase estacionaria, entran en juego distintos tipos
de interaccin: hidrofbicas, puentes de
hidrgeno, interacciones dipolares y
electrostticas.

El Componente ms afn a la fase estacionaria se retiene

ms y tarda en eluir.
El tamao de la molcula en disolucin determina el
tamao de poro de la columna (100,300)

Ventajas de la Cromatografia:

1. Anlisis Simultneos.
2. Alta Resolucin.
3. Alta Sensibilidad (rangos
de concentraciones a
niveles de ppm - ppb)
4. Pequeos Volmenes de
Inyeccin (de 1 a 100 uL).

Tipos de Cromatografa:

Tipos de Cromatografa:
- DE ADSORCIN: FE= Slido y FM= Lquido o gas. Los solutos se

adsorven temporalmente.
- DE PARTICION: FE= Lquido y FM= Lquido o gas. Los solutos se
separan por la solubilidad relativa en los solventes empleados.
- DE INTERCAMBIO IONICO: FE= Slido con grupos funcionales
inicos y FM= Lquido (Buffers).
- DE EXCLUSIN DE TAMAO: FE= Polmero con poros de
dimensin molecular. FM= Lquida gaseosa.

Divisiones de la Cromatografa

Tcnicas cromatogrficas
Se diferencian por la fase mvil y la fase estacionaria que se utilizan para la separacin

Mecanismos de Separacin de
HPLC

La fase reversa es el mecanismo de separacin ms empleado en HPLC

TIPOS DE CL:
1.- CROMATOGRAFIA DE REPARTO:
Soporte bsicamente por Slice, la superficie de la slice totalmente hidrolizada
por grupos SIOH Q. Reactivos. Recubrimientos de fase enlazada: Siloxanos
(Cadena C8 o C18).

RELLENOS DE FASE INVERSA Y FASE NORMAL:

Fase Inversa: FE = No Polar (HC), FM = Polar (agua, MeOH, Acn).
En FI: R del siloxano = C18, C8
Fase Normal: FE = Polar( Slice), FM = Apolar ( Hexano, CHCl3 ).
En FN: R del siloxano = CN, DIOL, NH2 (de menos a ms polar)

TIPOS DE CL:
2.- CROMATOGRAFIA DE ADSORCION:
Lquido - Slido. nicas fases en HPLC son: Slice y la almina.
(Experimentar: CCF, COMPUESTOS NO POLARES)
3.- CROMATOGRAFIA INICA:
Separacin y determinaciones de iones que se basan en el uso de las resinas
de intercambio inico.(Aminocidos).
4.- CROMATOGRAFIA DE EXCLUSIN POR TAMAOS:
CROMATOGRAFIA EN GELES PERMEABLES de filtracin en geles, para
especies de alto peso molecular.

COLUMNAS HPLC

-Caractersticas
- Seleccin

Columnas Analticas

MORFOLOGIA DE LAS SILICAS TAMAO DE PARTICULA Y DE PORO

Prametros de Seleccin de Columna

- Tamao de Poro (80 ;100 ;300 )
- Tamao de Partcula (3; 5 y 10 um)
- Longitud (35 mm; 75 mm; 125 mm)
- Dimetro Interno (4 mm; 4,6 mm
- Fase Estacionaria (L1; L3; L7; L9,)

Prametros de Seleccin de Columna

Tamao de Partcula Tamao de Poro

80 PORO

3,5 um; 5um; 10 um PARTICULA

Prametros de Seleccin de Columna

Tipo de Silice y Fase ligada pH y Fase mvil
Analitos de inters
pH
Ejm:
AGILENT (Zorbax)
MERCK (Lichrospher)
SB
Purospher (pH 1,5 10,5)
Eclipse XDB
Select B (C8 modificado,)
Extend C18
Purospher(e) (pH 1,5 10,5)
Bonus-RP
Lichrospher (pH 2,5 7,0)

Preparacin de Fase Ligada

Seleccin de Columnas Fase Estacionaria

Seleccin de Columnas Fase Estacionaria

Seleccin de Columnas Fase Estacionaria

Seleccin de Columnas Fase Estacionaria

Columnas Analticas - Cartuchos

Columnas Analticas

Columnas Analticas

- Caractersticas comunes: Longitud entre 10 y 30 cm, d.i.= 4 a 10 mm,

tamao de particula del relleno: 3 a 10 um
- Los rellenos de fase enlazada se clasifican como de fase inversa cuando
el recubrimiento unido Qx. Carcter NO POLAR y de fase Normal el
recubrimiento grupos funcionales: POLARES.
- Un recubrimiento enlazado se puede tratar como si fuera un lquido
convencional retenido fsicamente.
- pH > 7,5 = Hidrlisis del Siloxano.
- pH < 2,5 = Destruccin del relleno.

Columnas Analticas

Columnas Analticas

CLASSES OF SILICABASED
BONDED PHASES
C18
C2
CH
PH

Octadecyl
Ethyl
Cyclohexyl
Phenyl

SPECIALTY PHASES
PBA
CERTIFY
ENVIRELUT
ACCUCAT

POLAR PHASES
Increasing polarity

NON-POLAR PHASES

CN
2OH
NH2
SI

Cyanopropyl
Diol
Aminopropyl
Silica

ION-EXCHANGE PHASES
SCX
CBA
SAX
NH2

Strong cation exchanger

Weak cation exchanger
Strong anion exchanger
Weak anion exchanger

Columnas Analticas

SYSTEM SUITABILITY TEST

Platos tericos:
Relacionado con el ancho del pico, mide la

eficiencia de la columna. Relaciona el tiempo

de retencin y el ancho de pico.
Afectado por el factor de cola

SYSTEM SUITABILITY TEST

Factor de Capacidad (k)

tr t0
k'
t0

Vr

tr = tiempo de Retencin del

Pico de un Soluto.

V0

El tiempo de Retencin puede

utilizarse para fijar el Volumen de
Retencin.

Injeccin

t0 = tiempo del Solvente (Pico

no retenido)

Vo

k = 0

SYSTEM SUITABILITY TEST

RESOLUCION (R)

La Resolucin es un ndice numrico que nos indica el grado de

separacin de dos compuestos. Esta puede expresarse utilizando
los siguientes parmetros:

Matemticamente esta se
expresa como:

2(V2 V1)
Rs =
(W1 + W2)

BUEN USO Y MANTENIMIENTO DE

LA COLUMNA CROMATOG.
Lavarla correctamente despus de su uso

Agua 1,0 -1,5 ml/min x 30 min

Metanol:Agua ACN: Agua 60:40
Circular peridicamente ACN o Metanol puro

BUEN USO Y MANTENIMIENTO DE

LA COLUMNA CROMATOG.
Filtrar la fase mvil y las muestras

Evitar partculas taponamiento

No utilizar elevadas temperaturas (< 60C)
Enfriar en forma gradual
Tapar los extremos

BUEN USO Y MANTENIMIENTO DE

LA COLUMNA CROMATOG.
Seguir la direccin de flujo
Cambiar el flujo <0,5 ml/min

Volumen muerto
Usar dentro del rango especificado de pH
Presin mx. de uso: 250 bar en cartuchos y
300 bar en columnas
Evitar impactos fuertes

BUEN USO Y MANTENIMIENTO DE

LA COLUMNA CROMATOG.
Destinar una columna para cada tipo de FM y

Forma Farmacutica
Verificar existencia de lnea base
Equilibrio de FM y columna
Depende de tipo de FM
10 volmenes de columna (25 ml de FM)
para columnas de 125mm

USO Y CUIDADO DE COLUMNAS

CROMATOGRAFICAS

GRACIAS