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PERMEASA GENERAL DE
AMINOáCIDOS EN
NEUROSPORA CRASSA
Jovani Catalán Dibene
25 de agosto de 2009
Contenido
Introducción
Antecedentes
Hipótesis
Objetivos
Metodología
Resultados
Conclusiones
Perspectivas
Introducción
Los hongos y su importancia.
El Reino Fungi
Eucariontes
Heterótrofos
Unicelulares o multicelulares
Reproducción sexual y asexual
Formadores de esporas
Pared celular
Matthieu Legendre
Importancia ecológica y
social
Importancia biológica
Importancia agrícola y socioeconómica
A LB E R T O N , O ., & K U Y PE R ,
T.
Hongos filamentosos
Ostiolo
Neurospora
Pared Asca con
crassa peritecial ascosporas
Mitosis,
Ascospora formación
germinando de
Hifa
vegetativa ascosporas
Microcoloniade la Meiosis
ascospora
Periteci II
o
División
Ciclo conjugada
sexual
Crozie
Conidia de tipo de Pared r
apareamiento distinto peritecia
l
Tricogina Croziers
Célula ascogonial
Núcleo ascogonial Hifa ascogena
Núcleo
fertilizante
Forsberg y Ljundahl,
Aminoácidos
Proteínas
Capaces de
biosintetizar los 20
aminoácidos
Nutriente más
transportado
Prefieren obtener que
fabricar
Utilizados como
fuente de carbono o
de nitrógeno.
Se requiere el NDP o
NCR
Coordinación entre
anabolismo y
Deacon, 2000.
catabolismo
Transporte de aminoácidos
S. N. crassa
cerevisiae
Dos tipos
Número de
permeasas
variable de
especie a
especie
S. cerevisiae 15
permeasas; N.
crassa 5
sistemas.
Sistema usado
para obtener
Horak, 1980
nitrógeno
La permeasa general de
aminoácidos
Rubio-Texeiro y Kaiser
En N. crassa
Objetivos particulares
Crecimiento en
Construcción del distintas fuentes de
plásmido nitrógeno
Microscopía confocal
BLAST
Gap1-F GCT CTA GAA TGG CCG CTT ACG GC 62.2 2.1 Este estudio
Gap1-R CTT AAT TAA ACA AAA AAA CCG ATA AAC C 52.6 Este estudio
pMF272F CAA ATC AAC ACA ACA CTC AAA CCA 54.5 Dependiente del inserto Freitag et al, 2002
pMF272-R-2 AGA TGA ACT TCA GGG TCA GCT TG 62 Riquelme Pérez et al 2007
MRp10 AGA GAC AAG AAA ATT ACC CCC TTC TT 62 3.2 Riquelme Pérez et al 2007
MRp11 AAC TAC AAC AGC CAC AAC GTC TAT ATC 62 Riquelme Pérez et al 2007
MRp12 ATA ATG AAC GGA AGG TAG TTG TAG AAA G 61 2.1 Riquelme Pérez et al 2007
MRp13 ATG GAT ATA ATG TGG CTG TTG AAA G 61 Riquelme Pérez et al 2007
Amplificaciones
Condiciones
Ciclos Descripción Temperatura (°C) Tiempo
1 Desnaturalización 94 2 min
30 Desnaturalización 94 30 s
Alineamiento Dependiente de oligos 30 s
Extensión 68° Dependiente del tamaño
1 Extensión final 68° 5 min
T^
C
Genoma
T
A
G
A
5’ 3’
. . . T A T^C
C G TT AA NCU10262.3 T
A T
C G
A T
A A
T^T
A T C C
G T C G AG A. . . ^T
A A A A T
T T
5’ 3’
Xba I Pac I
Construcción del plásmido
G A
C T A
NCU10262.3 TA TT A
Obtención de
transformantes
Secuenciación y transformación
en N. crassa
Electroporació
Lisis alcalina Secuenciación n
1 µg/µl de
plásmido
en 40 µl de
conidias
Condiciones de
electroporación
1.5 kV
25 µF
600 Ω
11-14 ms
Crecimiento en distintas
fuentes de N
Reactivo
Na3C6H5O7x
KH2PO4
NH4
MgSO4
CaCl2
Solución
NO3
x 2H2O
xde
Anhidro
7H2O
Anhidro
elementos
biotina
5.5 H2O
(0.1mg/ml)
traza * Cloruro
Nombrede
Citrato
Fosfato
Nitrato
Sulfato de
desodio
calcio
magnesio
amonio
potasioanhidro 250
Gramos
15
25
110
0.5
500 uL
357.1515
246.48
147.014 g/mol
g/mol
g/mol monobásico
anhidro
Nitrato de
potasio
Urea MMV
Microscopía confocal
La proteína sGFP tiene su excitación máxima a 488
λ emisión máxima 510 λ.
R3 R2 R1
Resultados
Análisis in silico
Amplificaciones
MPM (-) ngap-1l
3,350 pb
2,027 pb 2,080 pb
1,904 pb
Clonación de la construcción
PCR en Minipreparació
colonias n pJCD - 1
MPM C1 C2 C3 C4
C5 C6 C7 MPM
2,027 pb
8,479 pb
2,027 pb
Selección de transformantes
Microscopio confocal LSM
510 Meta de Carl Zeiss®
Membrana - - -
Vacuolas +++ + +
globulares
a b c
NH 4 NO 3 ( MMV )
d e f
Localización de la proteína
nGAP-1l
Fuente de N
MMV KNO3 Urea
Localización NH4NO3
Membrana - - -
Vacuolas +++ + +
globulares
a b c
KNO 3
d e f
Localización de la proteína
nGAP-1l
Fuente de N
MMV KNO3 Urea
Localización NH4NO3
Membrana - - -
Vacuolas +++ + +
globulares
a b c
Comprobación de la integración
2 . 37
Kb
HindI Nde Mut HindI
II I II Nde SmaI
His - 3 - I
3 ’ His - 3 región flanqueante
3 Kb
5 ’ DHis - 3
gfp + gen + 3 ’ His - 3 región flanqueante
pccg1
3 , 2 Kb 2 , 1 Kb
MPM
pMR10-11 3,350 pb
pMR12-13 3.2 kb
2.1 kb
2,027 bp
Morfología y crecimiento
# 9718 tJCD-1
24 H
Morfología y crecimiento
Conclusiones
La proteína NCU10262.63 llamada ngap-1l no es el ortólogo
del sistema general de aminoácidos de levaduras, a pesar
de ser la más parecida en estructura a Gap1p.
La proteína ngap-1l es expresada dependiendo de la fuente
de nitrógeno en el medio. La expresión es localizada en
vacuolas tubulares cercanas a la punta.
Los estudios realizados indican que es probable que se trate
de una permeasa relacionada con el metabolismo del
nitrógeno. Para determinar si se trata de una permeasa
que se expresa en vacuola, es necesario realizar otro tipo
de estudios.
En el caso de la permeasa general de aminoácidos en
organismos de diferentes clases taxonómicas, la similitud
en secuencia no es indicador de homología en función, a
pesar de ser genes conservados.
El estudio de la localización de la permeasa general de
aminoácidos podría ayudar en el entendimiento de la ruta
de secreción en N. crassa, gracias a su regulación
Perspectivas
Conseguir cepas homocariontes de la
cepa tJCD-1
Fusionar la cepa tJCD-1 con la VMA-1
Estudios bioquímicos
Marcar al menos otros 2 genes arrojados
con el BLAST, en especial el gen naap-1.
Gracias