ABSORCIOMETRIA vs.

FLUORIMETRIA/FOSFORIMETRIA
Solucin

Absorciometra
Po

Detector

D. von Baer 2003

ABSORCIOMETRIA vs. FLUORIMETRIA/FOSFORIMETRIA

Solucin

Absorciometra
P

Po

Detector

Detector
Luz emitida
Fluorimetra

Solucin

PF

Po

D. von Baer 2003

Fluorescencia y Fosforescencia Molecular

Son procesos fotoluminiscentes en que molcula emite
radiacin que absorbi
Fluorescencia: Si emisin ocurre HASTA 10- 8 seg despus
de absorcin de luz
Fosforescencia: Si emisin ocurre DESPUES de 10- 8 seg
de Absorcin de luz
Absorcin de luz obedece a ecuacin: E = h
*
Energa (erg)
Cte. de
Planck
(erg seg)

Frecuencia
(ciclos
seg)

Niveles energticos de las molculas: relacionados con

enlaces moleculares
D. von Baer 2003

Energa

Fluorescencia y Fosforescencia

So
Estado electrnico fundamental
D. von Baer 2003

Fluorescencia y Fosforescencia
2 singlete excitado

S2

Energa absorbida por la molcula se puede disipar como:

Calor
Reaccin Fotoqumica
Calor + Fluoresencia
Calor + Fosforescencia

Energa

S1
Absorcin

Absorcin

1er singlete excitado

So
Estado electrnico fundamental
D. von Baer 2003

Fluorescencia y Fosforescencia
2 singlete excitado

1er singlete excitado

Energa

Fluorescencia (<10-8seg)

S1
Absorcin

Absorcin

Calor

S2

So
Estado electrnico fundamental
D. von Baer 2003

Fluorescencia y Fosforescencia
2 singlete excitado

1er singlete excitado

Cr
en uce
sis tre
tem
as

1er triplete excitado

T1

Energa

Reordenamiento interno

Fluorescencia (<10-8seg)

S1
Absorcin

Absorcin

Calor

S2

So
Estado electrnico fundamental
D. von Baer 2003

Fluorescencia y Fosforescencia
2 singlete excitado

S2

T2
1er singlete excitado

T1

Energa

1er triplete excitado

(> 10-8seg)

Cr
en uce
sis tre
tem
as

Fosforescencia

Reordenamiento interno

Fluoresencia (<10-8seg)

S1
Absorcin

Absorcin

Calor

2 triplete excitado

So
Estado electrnico fundamental
D. von Baer 2003

 emisin
> excitacin

D. von Baer 2003

(ESPECTRO) FLUORIMETRO

Selecc.
excitacin

Po

Ranura

Muestra

PF

P
Luz transmitida

Luz emitida

Filtro
Fuente
Luminosa

Selecc.
excitacin

Lectura

Amplificador

Detector

D. von Baer 2003

(ESPECTRO) FLUORIMETRO

Selecc.
excitacin

Po

Ranura

Muestra

PF

P
Luz transmitida

Luz emitida

Filtro
Fuente
Luminosa

Selecc.
emisin

Lectura

Amplificador

Detector

D. von Baer 2003

(ESPECTRO) FLUORIMETRO

Selecc.
excitacin
Ranura

Po

Filtro o
monocromador

Fuente
Luminosa
Lmpara de alta intensidad emisin
Xe: espectro continuo
Hg: esp. discreto

Lectura

Amplificador

Muestra

PF

P
Luz transmitida

Luz emitida

Filtro

Selecc.
emisin

Detector

Filtro o
monocromador

De alta sensibilidad
(Fotomultiplicador)

D. von Baer 2003

CUBETAS DE MEDIDA FLUORIMETROS

Cuatro caras transparentes
Segn rango , de vidrio o de cuarzo
Fluorimetra: tcnica de muy alta sensiblidad
CUBETAS MUY LIMPIAS
SOLVENTES MUY PUROS

Normal

Para volmenes pequeos

D. von Baer 2003

Determinaciones Cuantitativas en Fluorimerta

Para soluciones diludas:

%I=k*c

%I
Con Solucin
ms concentrada

100

Calibracin
escala de
lectura:
Con blanco

0
Concentracin
D. von Baer 2003

Ejemplos de Aplicaciones de la Fluorimetra

En Bioqumica:
Cuantificacin de DNA: Microplacas
Cuantificacin de AMP cclico
Estudios de enlace molecular (Binding)
En Inmunologa:
Cuantificacin de Reacciones de Inmunoflurescencia
En Qumica Ambiental:
Deteccin de Compuestos Aromticos Policclicos
Cuantificacin de iones en aguas mediante reactivos
Fluorognicos
En Biologa Celular:
Estudios de enlace (binding) celular
Determinacin de Ca, K, Cl y pH en clulas mediante distintos
reactivos cromognicos

D. von Baer 2003

ABSORCIOMETRIA, TURBIDIMETRIA y NEFELOMETRIA

Solucin

Absorciometra
P

Po

Luz transmitida

Turbidimetra
P

Po

Nefelometra

Detector
Ps

Suspensin

Luz dispersada

Po

D. von Baer 2003

ABSORCIOMETRIA, TURBIDIMETRIA y NEFELOMETRIA

Solucin

Absorciometra
P

Po

Luz transmitida

Turbidimetra
P

Po

Nefelometra

Detector
Ps

Suspensin

Luz dispersada

Po

D. von Baer 2003

ABSORCIOMETRIA, TURBIDIMETRIA y NEFELOMETRIA

Solucin

Absorciometra:
Se mide luz absorbida
P

Po
Turbidimetra:
se mide disminucin
luz transmitida

Luz transmitida
P

Po

Nefelometra:
se mide directamente la luz
dispersada

Detector
Ps

Suspensin

Luz dispersada

Po

D. von Baer 2003

DETERMINACIONES CUANTITATIVAS EN
TURBIDIMETRIA y NEFELOMETRIA
En suspensiones diludas, para un haz de rayos paralelos y una dada

log P/ Po = k b c
Dispersin de luz en la suspensin depende de:
Nmero de partculas (concentracin)
Tamao y forma de las partculas
de la radiacin. La luz azul de (< ) es dispersada ms que luz roja
INTERFERENCIAS
Cualquier reabsorcin de luz afectar medicin luz DISPERSADA
Elegir en que muestras tengan mnimo de absorcin
Dependencia de T, densidad y muchos otros parmetros
Aplicaciones prcticas de turbidimetra y nefelometra generalmente se
basan en procedimientos empricos y se debe tomar especial cuidado en
reproducir todas las condiciones de trabajo: T, densidad, pH, agitacin,
concentracin de reactivos y muchos otros parmetros
D. von Baer 2003

DETERMINACIONES CUANTITATIVAS EN
TURBIDIMETRIA y NEFELOMETRIA
En suspensiones diludas
Para un haz de rayos paralelos
A una dada

log P/ Po = k b c
Dispersin de luz en la suspensin depende de:
Nmero de partculas (concentracin)
Tamao y forma de las partculas
de la radiacin. A Luz azul de (< ) es dispersada ms que luz roja
INTERFERENCIAS
Cualquier reabsorcin de luz afectar medicin luz DISPERSADA
Elegir en que muestras tengan mnimo de absorcin
Nmero de partculas (concentracin)
Dependencia de T, densidad y muchos otros parmetros
D. von Baer 2003

Ejemplos de Aplicaciones de la Turbidimetra y Nefelometra

En Qumica Clnica:
Cuantificacin de Protenas en Lquidos Biolgicos mediante
Reactivo de Precipitacin Ac. Sulfosaliclico
En Inmunologa:
Cuantificacin de Reacciones de Precipitacin con
Inmunoglobulinas altamente selectivas
En Qumica Ambiental:
Determinacin de turbidez de agua
Cuantificacin de iones en aguas mediante reactivos
de precipitacin. Ej: sulfato
En Microbiologa:
Cuantificacin del nmero de clulas en un medio de cultivo :
Curva de Crecimiento

D. von Baer 2003