UNIVERSIDAD CENTRAL DEL

ECUADOR
FACULTAD DE CIENCIAS
MEDICAS
ESCUELA DE MEDICINA
CATEDRA DE BIOLOGIA MOLECULAR
TEMA: ELISA
PERIODO 2015

ELISA
La palabre proviene del

acrnimo en ingls EnzymeLinked ImmunoSorbent

Assay, Ensayo por
Inmunoabsorcin Ligado a
Enzimas)

Antecedentes
EN 1960 Rosalyn Yalow Y Salomon Berson, desarrollaron
el R.I.A (Radioinmunoensayo)
Deteccin de Ags o Acs marcados con radioisopos
La radioactividad proporciona una seal que indica si
un Ag o Ac especfico est presente en la muestra.
Se buscaron otras alternativas seguras para el medio
ambiente, que no perjudicarn la salud, de menor
costo, sencilla y prctica
E.I.A Enzima inmunoensayo se desarrollo
independientemente por Stratis Avrameas y Pierce.
Usa la unin de Acs a los Ags para identificar y medir
sustancias, por colorimetra.

Antgenos
Los antgenos son, por definicin,
generadores de anticuerpos.
Incluyen protenas, polisacridos y
varias molculas pequeas, que
estimulan
la
produccin
de
anticuerpos.
Los antgenos son, a menudo,
molculas que se definen como (no
propias) o extraas, para el
organismo.
Hay (antgenos propios) que actan
como etiquetas de identificacin

Anticuerpos
Son la respuesta del organismo ante la
presencia de un agente infeccioso.
Los anticuerpos son molculas proteicas
secretadas por los plasmocitos, y tienen
una altsima afinidad por sus antgenos
correspondientes.
Anticuerpos se caracterizan por:
Ser Defensa natural
Tener Utilidad teraputica
Tener Utilidad Diagnstica
Marcador de Infeccin o
Exposicin.
Deteccin de antgenos
Los anticuerpos utilizados en el mtodo
ELISA son de origen monoclonal o
policlonal.

ELISA
Es una tcnica de inmunoensayo en cual un Ag o Ac

inmovilizado se detecta mediante un anticuerpo enlazado a

una enzima capaz de generar un producto detectable al
cambiar de color

ELISA
Se usa para determinar si un anticuerpo

o antgeno en particular est presente

en una muestra de estudio.
Gran nmero de variables: seleccin de

reactivo, temperatura, medicin de

volumen y tiempo determinan la
reaccin

ELISA
La

interaccin
antgenoanticuerpo en el laboratorio
puede
ser
utilizada
para
determinar si un paciente tiene
una infeccin o una enfermedad
autoinmune.

Pero como prueba diagnstica,

posee diversas limitaciones que

conviene conocer:

LIMITACIONES
1. Resultado positivo para anticuerpos no significa que
necesariamente el paciente esta enfermo

2. Inmunosupresin puede dar un falso negativo o puede

estar en una venatana inmunolgica y dar falso
negativo

3. Inespecificidad entre antgeno - anticuerpo

VENTANA INMUNOLGICA
El tiempo que transcurre entre el momento de
la contaminacin por un virus y la produccin
de anticuerpos suficientes para ser detectados
en la serologa es llamado de ventana
inmunolgica. Por lo tanto, cuando decimos
que un examen tiene una ventana inmunolgica
de 3 meses, eso significa que el examen slo
dar positivo 3 meses despus de que el
paciente haya entrado en contacto con el
determinado virus o bacteria.

ELISA
Tambin, debemos tener en cuenta que cuando

se trata de diagnosticar una enfermedad que

posee un valor predictivo positivo bajo en una
determinada poblacin, es necesario volver a
confirmar el resultado positivo mediante otro
mtodo de diagnstico independiente.

ELISA
Normalmente, se lleva a cabo un western blot donde se

detecta la presencia de varios anticuerpos

ELISA
El resultado del western se considera positivo cuando

aparecen al menos 5 bandas, que indica que 5 anticuerpos

diferentes estn presentes en el sujeto frente a esa infeccin.

Es entonces

cuando se
diagnostica como
positivo a dicho
paciente.

ELISA
Dispositivos empleados en ELISA

Lectores ELISA.

Se usan desde tubos de

cristal desde los mas
antiguos hasta las
actuales microplacas de 96
pocillos de plstico tratado

para aumentar su
capacidad de adsorcin
(en su superficie) de
molculas, y con fondos de
pocillo pticamente claros
que permitan realizar las
medidas de densidad
ptica en instrumentos
especficos

Actualmente dispositivos
de mayor capacidad
con 384 y 1536 pocillos
para los
screening masivo de los
sistemas robotizados

ELISA
Dispositivos empleados en ELISA

ELISA
Dispositivos empleados en ELISA

Los lectores ELISA son

espectrofotmetros capaces de
realizar lecturas seriadas de cada uno
de los pocillos de la placa ELISA.

ELISA
Dispositivos empleados en ELISA

A diferencia de un
espectrofotmetro
convencional, con capacidad
de leer todas las longitudes
de onda del ultravioleta y el
visible de manera continua,

los lectores de ELISA

disponen de sistemas de
filtros que solo permiten la
lectura de una o pocas
longitudes de onda

Controles
Se utilizan para asegurar que la prueba esta funcionando
correctamente
Control POSITIVO

Incluyen una sustancia que se sabe que reaccionara

positivamente, proporcionando as, un patrn sobre el cual
basar los resultados.

Control NEGATIVO

Incluyen sustancias que no deben reaccionar.

Tipos de ELISA
Los mtodos de ELISA dependiendo de la
actividad enzimtica se dividen en dos tipos:

Competitivos
2. No competitivos
1.

Tipos de ELISA
ELISA COMPETITIVO:
El anticuerpo de la muestra va
a competir con el conjugado
por un nmero limitado de
sitios de unin del antgeno.
Habr ausencia de color en
una muestra positiva debido a
que el sustrato no encontrar a
la enzima porque el conjugado
ha sido desplazado por el
anticuerpo presente en la
muestra

Tipos de ELISA
ELISA NO COMPETITIVO:

Si una muestra es positiva se formar

el complejo antgeno-anticuerpo y al
agregar el conjugado reaccionar con
el respectivo sustrato dando color
Dentro de los no competitivos
tenemos:
Los directos que detectan antgenos
Los indirectos que detectan

anticuerpos

Fases del ELISA Indirecto

Fijacin al soporte insoluble de antgenos especficos para

los anticuerpos objeto de estudio. Lavado para eliminar los

antgenos fijados deficientemente o no fijados.
Adicin del suero problema, de tal forma que sus
anticuerpos reaccionarn especficamente con los antgenos
fijados al soporte. Lavado para eliminar los anticuerpos
marcados que no hayan reaccionado.

Fases del ELISA Indirecto

Adicin de anti-anticuerpos conjugados con una enzima, los cuales

reaccionan con los anticuerpos especficos aadidos en el paso

anterior y que se encuentran fijados a los antgenos. Lavado para
eliminar los anti-anticuerpos marcados que no hayan reaccionado.
Adicin de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la
enzima marcadora. Se puede parar la reaccin si se desea.
Lectura visual o colorimtrica del producto final coloreado

Prueba ELISA Indirecta

Leyenda
Antgeno
Anticuerpo
Primario

Anticuerpo
Ligado a Enzima
Sustrato

Tipos de ensayos
(ELISA SANDIWCH)

Aplicaciones del ELISA

Deteccin de antgenos o anticuerpos:
Virus
Hongos
Parsitos
Bacterias.
Deteccin de autoanticuerpos:
IgG (Factor reumatoideo)
DNA
Protena del ncleo

Aplicaciones del ELISA

Medicin de Hormonas:
Progesterona, estrgenos, cortisol,
insulina,
testosterona, gonadotropina
corinica humana, TSH.

Deteccin de antgenos tumorales:

Antgeno prostticoAlfa-fetoprotena
Antgeno del ovario
Antgeno carcinoembrionario

Importancia
En

estudios serolgicos, hematolgicos,

endocrinolgicos,
oncolgicos,
en
los
transplantes, la medicina forense y la
antropologa.

Los

resultados
aportan
elementos
diagnsticos, informacin de una enfermedad
y coadyuvan en la planificacin del tratamiento

Consideraciones
Formacin de una o ms capas de
inmunocomplejos.
Es el ensayo de competicin del antgeno. En esta etapa es muy
importante controlar los factores tiempo y temperatura de
incubacin para evitar la aparicin de falsos negativos.
En el caso del tiempo, si es inferior a 15 minutos, no ocurrir la
interaccin antgeno-anticuerpo y el color no ser evidente al final del
ensayo, dando un falso negativo.
Por su parte, si la temperatura de incubacin es muy baja, la formacin
del complejo antgeno-anticuerpo tampoco se completar en el tiempo
establecido,
Mientras que si la temperatura es muy alta, las protenas (antgeno y
anticuerpo) se desnaturalizan y, por tanto, disminuyen su capacidad
para interaccionar, dando igualmente falsos negativos.

Consideraciones
Revelado de la reaccin enzimtica.

Despus de un lavado para

eliminar todas las molculas
marcadas no fijadas en forma de
inmunocomplejos, se aade el
sustrato enzimtico en solucin. Se
deja reaccionar y se lee la
densidad ptica mediante
espectrofotometra.

Lector ELISA

Conjugado: Enzima
La enzima escogida como marcador debe:
Unirse fcilmente a antgenos y anticuerpos,
Encontrarse en estado puro a un precio razonable y
Tener un substrato cromognico o fluorognico conveniente y de fcil
preparacin.

Las enzimas ms
utilizadas son fosfatas
alcalina, peroxidasa de
rbano y -galactosidas

ELISA DE CUARTA GENERACIN

Identificar anticuerpos contra el VIH ms
precozmente, sino tambin investiga el antgeno
P24, una protena existente en el virus VIH.
El ELISA 4 generacin es, por lo tanto, un examen
doble que busca anticuerpos y al propio virus.
Ventana inmunolgica de 4 semanas (en algunos
casos en hasta 2 semanas).