Universit Amar Telidji Laghouat

Dpartement de biologie

COMPOSANTS ANTIOXYDANTS DE VIBURNUM OPULUS L.

ERMINS EN LIGNE PAR HPLC-UV-ABTS PIGEAGE DES RADIC
ET DES MTHODES LC-UV-ESI-MS.
EXPOS PAR :
o

ASMA BENHAMIDA

BEN AICHA NADIA

PROPOS PAR:
MELLE: BOUSSOUSSA

PLAN DE TRAVAILLE:

Introduction
une tude bibliographique
le matriel et les mthodes
rsultats et discussions.
conclusion

INTRODUCTION
Ces dernires annes, nous avons assist un regain dintrt des consommateurs pour les
produits naturels. Cest pour cela que les industriels dveloppent de plus en plus des procds
mettant en uvre des extraits et des principes actifs dorigine vgtale.
Parmi ces nouveaux composs potentiellement intressants, les antioxydants, tels que les
flavonodes, ont t particulirement tudis en raison de leur utilisation dans les domaines
pharmaceutiques, cosmtiques et alimentaires
Lapport rgulier en phytonutriments possdant des capacits anti-oxydantes significatives est
associ une faible prvalence de maladies lies au stress oxydatif (cancers, maladies
cardiovasculaires ) et un faible taux de mortalit
Cest pourquoi nous nous sommes intress de faire une tude phytochimique de la plante
Viburnum opulus L. poussant a la rgion d'Est de la mer noir ainsi dvaluer leur activit
antioxydante.

Dtermination des composs

phnoliques totaux de
Viburnum Opulus L .

Objectif

valuation de l'activit
antioxydant

Analyse et identification des

composes phnoliques possdent
une activit anti oxydante

Premire partie
Etude
bibliographique

Les antioxydants
Un antioxydant est toute substance, prsente une concentration infrieure celle du
substrat oxydable, qui est capable de retarder ou de prvenir loxydation de ce substrat
et neutraliser les radicaux libres
Quelques antioxydants sont fabriqus par le corps humain, dautres tels les vitamines et
poly phnols, doivent tre apports par l'alimentation.
Une dficience ou une absence de production d'antioxydants entrane unstress oxydatif
pouvant endommager ou dtruire lescellules et entraine beaucoup de maladies
pathognes
les composs phnoliques sont des antioxydants capables de donner un atome dhydrogne au
radical libre et le convertir en un compos stable non radicalaire.

Pigeage du radical 2,2-diphnyl-1picrylhydrazyl (DPPH)

Le DPPH est initialement violet, se dcolore lorsque llectron clibataire sapparie ou son
radical libre est neutralis. Cette dcoloration montre la capacit des composs phnoliques
piger ces radicaux libres .
La rduction du radical DPPH par un antioxydant peut tre suivie par spectrophotomtrie UVvisible, en mesurant la diminution de labsorbance provoque par la prsence des extraits
phnoliques.

Pigeage du ABTS (2,2-azynobis-[3-ethylbenzothiazoline-6- acide sulfonic])

Dans la mthode TEAC (Trolox equivalent antioxidant capacity), lactivit antioxydante totale
dune molcule est dduite par sa capacit neutraliser le radical ABTS + obtenu partir de
lABTS comparativement un antioxydant de rfrence : le Trolox

la capacit de Rduction du fer: FRAP

cette technique a t dveloppe pour mesurer la capacit de rduire le fer ferrique (Fe +3)
en fer ferreux (Fe+2).
Le Fe2+ forme un complexe avec la 2,4,6-tris(2-pyridyl)-1,3,5-s-triazine (TPTZ) de couleur
bleue .la formation de ce complexe indiquera un pouvoir rducteur (antioxydant).
Les valeurs d'absorbance d'chantillons obtenus sont compars avec celle dun mlange
ractionnel contenant une concentration connue en Fe2+

Etude botanique de Viburnum- opulus .L

Laviorne obier(Viburnum opulus) est unarbuste(plante ligneuse)de la famille
des Caprifoliaceae
appel aussi Boule de neige, canneberge europen, rose de Gueldre, obier, viorne
aubier
La viorne obier est rpartis en Amrique du Nord (aux tats-Unis et au
Canada), en Europe et dans une grande partie de l'Asie
L'obier en russe nomm, (kalina), l'origine de la clbre chanson Kalinka petite
baie d'obier. L'obier chez les Ukrainiens notamment, est un symbole d'amour; on le
retrouve dans de nombreux contes et chansons.

Le fruit a une couleur rouge fonc et utilise comme nourriture ou de boisson dans de
nombreuses formes diffrentes, y compris les jus de fruits, de la marmelade, et de la
confiture.
Le fruit a t utilis pour traiter un large ventail du maladies cardiaques, l'hypertension
artrielle, des saignements, la toux, le diabte et les problmes digestifs.
le fruit de Viburnum. opulus contient des quantits leves dacides phnoliques, les
flavonodes et les anthocyanes ainsi que des acides organiques, telle que lacide ascorbique et
L-malique .

deuxime partie
Matriel et
mthodes

Le matriel vgtal et la prparation des chantillons:

L'chantillon des fruits ont t collects l't 2010 Trabzon, Turquie.
Le
et

fruit a t fractionn en ppins, pricarpes et jus de fruit. Les pricarpes

les ppins ont t laves et sches 40 C.

un mixeur de mtal a t utilis pour le broyage en une poudre sche.

Une masse de poudre de 5-10g est transfr dans un ballon
pour lextraction (mthanol,
60 C pendant deux heures

actonitrile et d'eau) sous agitation 600

sous un condenseur pour viter la perte de

tpm
solvant.

Aprs l'extraction, le mlange est filtr (0,45 filtre seringue) le filtrat

utilises pour l'analyse par HPLC
Les extraits ont t tiquets et maintenus 18 C jusqu' l'essai.

Produits chimiques et ractifs:

KH2PO4

HPLC-grade water
(leau de qualit HPLC)

HPLC solvant de
qualit

MnO2

l'acide formique

Actonitrile

NaCl
KCl

mthanol

Na2HPO4

le t-resvratrol

acide gallique
HPLC standards de
HPLC standards de
qualit
qualit

ABTS

kaempfrol

Acide protocatchuique

la rutine querctine

l'acide p-OH benzoque

l'acide syringique

l'acide cafique
la catchine

la vanilline

l'picatchine

la 4-OH cinnamique acide

Dtermination des composs phnoliques totaux:

50L

C P totaux des extraits de V. opulus ont t dtermines avec le ractif de Folin-Ciocalteu

selon la mthode des Slinkard et Singleton en utilisant l'acide gallique comme standard.
Incubation a
3min
250 L ractif
de FolinCiocalteu

2.5 mL eau
distill

Solution mre
1000g/ml
MeOH et
acetonitrile

Etablir la courbe
dtalonnage on
utilisant l'acide
gallique comme
standard

750 L Na2CO3
Agitation par
vortex
incubation pendant 2 h
temprature ambiante.

L'absorbance a t
mesure 765 nm

le test (FRAP) pouvoir antioxydant de rduction de Ferre:

50L

incubation pendant
20 min
temprature
ambiante.

1.5 ml ractif
de FRAP

tampon
actate

L'absorbance a t
mesure 595 nm

Etablir la courbe
dtalonnage on
utilisant le TROLOX
quivalent comme
rfrence

TPTZ

FeCl3
6H2O

Solution mre
1000g/ml
MeOH et
acetonitrile

La capacit de pigeage des radicaux ABTS+ :

ABTS+ est stable
pendant plus de deux
jours lorsqu'il est
conserv dans
l'obscurit la
temprature ambiante

EeOH

EeOH

2,45 mM de persulfate de potassium

dans l'thanol: eau (1: 3) et on laisse
reposer dans l'obscurit la
temprature ambiante pendant 16-20 h
pour prparer ABTS+

ABTS+ a t dilu pour

le test hors ligne.

L'absorbance a t
mesure 734 nm.

La capacit anti-radicalaire
des chantillons a t
exprime SC50

ABTS a t dissous
l'thanol: eau (5: 1)
prparer une solution
ABTS 7mM.

dans
pour
stock

La SC50 (scavenging concentration

50%) permettant de calculer la
concentration dextrait ncessaire
pour piger 50% des radicaux

nn
ppoo
TTaa
e
e
d
d
ttee
rraa
cciitt

M
M
eeO
O
HH

lanalyse d'activit de pigeage des radicaux HPLC-UV-ABTS / DPPH En

ligne:
Prparation de DPPH et ABTS+

DPPH et ABTS+ ont t

prpares quotidiennement
et protgs de la lumire
et refroidis dans la glace.

250 ml (40 mM) tapon

de citrate de PH=6

0.02g DPPH in 750 ml

mthanol
8 g NaCl

AABB
TTSS

La solution de
DPPH est
dgazer
pendant 30 min

0.27 g KH2PO4
1.4 g Na2HPO4
0.15 g KCl

Mixer pd 10 min
a T ambiante +
filtrer

ABTS+ preparer par 2 g

MnO2 + 1L (0.02) mM
ABTS dans le tampon PBS

Tampon PBS PH=7.4

lanalyse d'activit de pigeage des radicaux HPLC-UV-ABTS / DPPH En

ligne:
la sparation et la purification de notre chantillon est effectu par HPLC ( colonne Luna
C18)
On utilise la post colonne pour la mise en vidence des composs possdent une activit
antioxydante (pigeurs des radicaux du DPPH et ABTS+) dans des solution aprs le premier
dtecteur c'est la raction de Derivatisation
Deux dtecteurs UV ont t utiliss; un dtecteur de VP 10A pour l'analyse UV directe des
composs et un dtecteur de 10A pour la dtection des composs ont l'activit antioxydante.
La colonne de garde (pr colonne) utilise pour la prvention contre les contaminations.
La phase mobile doive tre dgazer afin dliminer les formes de boulles ,Constitue par :
(solvant A) d'acide formique 0,1% dans l'eau et (solvant B) l'acide formique 0,1% dans
de l'actonitrile, Le dbit de l'luant :0,5 mL / min et la dtection a 280nm
Le volume d'injection tait de 20 L, a temprature 25C.
le dbit d'injection de DPPH et ABTS+est: 0,8 mL / min ,la dtection a t effectue
414 et 521 nm, respectivement.
La dtection de ABTS en ligne a414 nm ; ABTS hors ligne a 734nm

L'analyse par HPLC-ESI-MS:

Afin d'identifier les composs phnoliques actifs prsents dans l'extrait du jus, HPLC-MS
avec une ionisation lectrospray (ESI) a t utilis.
Les conditions du systme HPLC (la temprature de la colonne, la longueur d'onde) sont les
mmes que dcrit prcdemment.
Une colonne Luna C18 a t utilis pour toutes les analyses
Le dbit tait de 0,3 mL/min
Le hlium et l'azote ont t utiliss comme gaz de collision et de nbulisation,
respectivement.

Troisime partie
Rsultats et
discussions

Figue. 1. capacits antioxydantes des jus

V. opulus (VOJ) et de mthanol (M),
l'actonitrile (A) et de l'eau (W) extraits
la graine (S) et la peau (K) .

de
de

(A) La Capacit antioxydante de

pigeage du ABTS+ exprimer en
SC50. SC50 prsente 50% de
radicaux pigs.
(B) la capacit antioxydante de
rduction du fer ; mthode de
(TEAC) valu par le test de
FRAP
(C) l'acide gallique quivalent
(GAE, g / ml) teneur totale en
composs phnoliques

CP glycosils

CP aglycones
CP aglycones

Figue. 2. analyses HPLC en ligne d'un mlange de composs phnoliques standards (A) avec ceux de jus
du V. opulus (VOJ) (B).
Les standards: (a) l'acide gallique, (b) l'acide 3,4-dihydroxybenzoque, (c) p-OH de l'acide benzoque,
(d) la catchine, (e) l'acide vanillique, (f) l'acide cafique, (g) de l'acide syringique, (h) picatchine,
(i) la vanilline, (k) l'acide cinnamique 4-OH, (m) la rutine, (n) t-resvratrol, (o) la querctine, (p) le kaempfrol.

Figue. 3. L'analyse en ligne de l'activit antioxydante de lextrait de la graine du V. opulus

(A) chromatogrammes UV obtenue 280 nm, (B) chromatogrammes de pigeage des radicaux
ABTS obtenue 414 nm.

Figue. 4. Analyse en ligne de l'activit antioxydante ona utilis: mthanol (VOKM),

actonitrile (VOKA) et de l'eau (VOKW) pour les extraits de peau du V. opulus
(A) chromatogrammes obtenu par UV 280 nm, (B) chromatogrammes de pigeage
des radicaux ABTS ABTS 414 nm.

Tableau: 1
composs phnoliques identifis par HPLCUVESI-MS de lextrait du jus (VOJ).

Proanthcyanidine mono glycoside

Dimre

picatechin

catechin
catechin

rutine

Figue. 5. Reprsente le chromatogramme HPLC-UV-ESI-MS de jus du V. opulus (VOJ):

a 280 nm .

Conclusions
Le test dABTS est plus sensible l'identification des antioxydants car sa cintique de
raction est plus rapide, et sa rponse aux antioxydants est plus lev.
le mthanol extraire plus les composs antioxydants para port a lActonitrile
A partir des testes antioxydants ABTS hors-ligne et en ligne, les extraits de ppins de
V. opulus ont une activit antioxydante plus levs que celle de lpicarpe.
Les composs identifis par HPLC-UV-ESI-MS sont: l'acide chlorognique, la catchine,
l'picatchine, la rutine, la querctine flavonodes, procyanidine B2, procyanidine trimre et
proanthocyanidines dimre mono glycoside.
Les rsultats obtenus dans cette tude montrent que l'extraits du jus de fruits possdent
une grandes quantits de composs phnoliques.

Merci pour votre

Attention