Polymerase Chain Reaction

( PCR )
Teknik amplifikasi in vitro sekuen DNA spesifik dalam suatu proses
siklik yang terdiri dari 3 steps reaksi : denaturasi, anealing primer
dan ekstensi primer dengan bantuan polimerase DNA yang
thermostabil, primer dan dNTPs
Dalam PCR biasanya digunakan sepasang primer yang masingmasing komplementer dengan sekuen ujung DNA target. Primerprimer tersebut disusun sedemikian rupa sehingga reaksi ekstensi
primer akan mengarahkan sintesis DNA secara berhadap-hadapan.
Dalam RAPD atau AP-PCR yang digunakan adalah bukan primer
spesifik, tetapi primer random untuk amplifikasi target random

Polymerase Chain Reaction (PCR)

DNA melting

Primer annealing

DNA elongation

Nobel Prize in Chemistry 1993,

at age 48
Kary Mullis
(invented PCR in 1983)
PhD
"The Cosmological Significance
of Time Reversal,"

Biochemistry from U.C. Berkeley

ww2.mcgill.ca/biology/undergra/ c200a/f07-16.gi

Exponential nature of PCR

amplification

Skema reaksi
PCR

PCR methods

PCR amplifies a given sequence in

an exponential fashion

In a perfect world, after 35 cycles,

one starting copy of a gene would
yield 236 copies of that DNA fragment
68 billion copies

Starting with 100 copies would yield

3.73 ug of DNA, plenty to be able to
sequence, clone and visualize on an
agarose gel

difficult to sequence one copy of a

gene and detect

very easy to sequence some of the

68 billion copies and detect

Polymerase Chain Reaction

(PCR)
Developed in the mid 1980s
Revolutionized molecular biology
DNA fragments can be amplified in large
amounts
In vitro technique
Kary Mullis - Nobel prize (1993)

What do we need for PCR?

Sequence information
Oligonucleotide primers
DNA
Nucleotides
Heat-stable DNA polymerase
Taq (Thermus aquaticus)

PCR technique
ds DNA
Step 1

Denature

Step 2

Anneal

Step 3

Extend

PCR amplifies DNA (gene)

1st cycle
2nd cycle
3rd cycle
4th cycle

5th cycle

6th cycle

PCR

Steps in PCR reaction

denaturation
separate parent strands
in preparation new
strand synthesis

PCR
annealing
stick primers to the
parent strands to prime
DNA synthesis
DNA synthesis requires
a primer to start DNA
synthesis

 extension
addition of nucleotides,
one at a time, to the
growing end of the DNA
strand (3 end) using
the parent strand as the
template

cycle through 25-35

times

PCR

PCR animation

www.biotechlab.nwu.edu/ pe/Sld022.htm

Melting Point Temperature

Denaturation
The more there is G or C, the higher Tm
The longer the primers, the higer Tm
0,2 m

Tm = 81,5C + 0,41(%G + %C) 550/n

n=number of nucleotides
Tm < 2C

Annealing State Temperature

Depends:
Concentration of primers
Composition of nucleotides

Normally takes only few seconds, but it is

programmed to 0,5-2 minutes
Building starts from the 3end

What time does it take?

Denaturation: 30 - 60 sec
Annealing: 30 - 60 sec
Doupling: 30 - 60 sec

25 - 35 cycles only (otherwise enzyme decay causes

artifacts)
72oC for 5 min at end to allow complete elongation of
all product DNA

Altogether: 7 min ( 8,5 min) * 25 (35) = 3h-5h

Try for equal Tm for both primers

use OLIGONEW or PRIMER software

Critical Factors for Successful PCR

Equipment
Thermal cycling profile & cycle number
Enzyme concentration
MgCl2 Concentration
dNTPs Conc.
Primer sequences
Template

1.Equipment :

a. Type of thermocycler :
- accurately & reproducibly 3 PCR incubation
temperature
- Ramp
- cycle between temperatures repeatedly &
reproducibly
b. Type of reaction tubes: affect heat transfer
- fit precisely into wells
- thin walls

2.Thermal cycling profile & cycle number

Initial denaturation: completely denature complex
genomic DNA accessible for primers
Primer annealin: the most critical factor in
designing a high specificity PCR
Primer extension:- opt.temp for Taq DNA pol. ~
72C
- +60 bases/sec. 20 ~ <500 bp
.

Denaturation step during cycling:

- Usually 95C ~ 20-30,

too low incomplete snaps back no acces for

primers

Cycle number
- Usually 25 35 cycles
-Cycle number increasesnon specific products
accumulate
-Tends to plateau effect :
- utilization of substrates (dNTPs or primers)
- stability of reactants (dNTPs or enzyme)
- end products inhibition (pyrophosphate , duplex
DNA)
- competition for reactanta by non specific product
or
primer-dimer

Final extension :
-usually 72C

5-15

-Promote completion of partial extension

products and annealing single stranded
complementary products

3. Taq DNA polymerase concentration :

-Optimum 0.5 2.5 U
-Increase enz.concdecrease specificity
4. MgCl2 concentration :
-Opt. 0.5-5.5mM,
-increase increase PCR product but decrease
specificity
-Mg : - influences enzyme activity
- increase Tm dsDNA & forms soluble complexes
with dNTPs to produce actual substrate that the
polymerase recoqnize
- Conc. Mg depends on conc.compound that binds
the ion such as dNTPs, Ppi, EDTA

5. DNTPs concentration :
-inbalanced dNTPs mixtures reduce Taq fidelity
-dNTPs reduce free Mg interfering polymerase activity &
decreasing primer annealing

6. Primers sequences:
-should be: - no internal secondary structure
-40 75 G/C content
-Balanced distribution of G/C & A/T rich domains
-No complementary between 3 end (no primer-dimers)

-Opt.conc. 0.1 0.5 M:

- too low lower yields
- too high promote mispriming & accumulation of non specific
products

7. Template:
-conc.should optimized
-Too little primers may not able to find target
-Too much lead to increase mispriming
-Template purity influences outcome of reaction.

8.General work strategies to avoid contamination

-Laboratory bench & equipments
-Cross contamination between samples
-Product from previous PCR amplification

Contoh aplikasi PCR

1. Deteksi penyakit infeksi

2. Deteksi kontaminasi agen infeksius
3. Deteksi penyakit genetik
4. Deteksi onkogen
5. Deteksi polimorfisme dalam populasi
6. Analisis evolusi
7. Keperluan penyidikan
8. Melakukan mutagenesis
9. Keperluan riset lain

APLIKASI BIOTEKNOLOGI dalam

pengedalian dan pemberantasan
penyakit
A.Deteksi dini
Deteksi dengan immunoassay :
ELISA, Imunohibridisasi, Imunositokimia

Deteksi dengan pelacak DNA :

Hibridisasi DNA

Deteksi dengan PCR :

Kualitatif
Kuatitatif : Competitive PCR/Light PCR

B.pengembangan vaksin

MISAL DALAM DIAGNOSA

LEPTOSPIRA

COMPETITIVE PCR FOR QUANTITATION OF

CHLAMYDIA TRACHOMATIS

Analysis of GMO food by PCR

GMO product approved by expert committee
GMO product distinguished by labelling
Expl.: soybean introduction of a glyphosate resistant
- 5-enol-pyruvinyl shikimate-3phosphate synthase (EPSPS)
gene
- element for expression EPSPS gene :
. CaMV derived 35S promoter
. Nophaline synthase(NOS) transcription terminator
sequence
A.tumefaciens
PCR kit for GMO detection : detect 35S promoter 195bp / 150
bp
detect NOS terminator 180 bp

SUMBER DNA
Diisolasi dari organisma yang akan dibuat
pustaka genomiknya
Ditentukan metoda isolasi yang sesuai
Disiapkan dalam kemurnian yang tinggi
Siap dilakukan fragmentasi dengan enzim
endonuklease restriksi

Teknik analisis polimorfisma berbasis PCR

PCR dengan primer spesifik
PCR dengan primer semispesifik (rep-PCR)
PCR dengan primer acak:
-Arbitrarily Primed PCR(AP-PCR) (Welsh & McCelland, 1990)
-Random Asmplified Polymorphic DNA-PCR (RAPD-PCR)
(William et al, 1990)

Keuntungan RAPD-PCR:
-menganalisis variasi genom suatu spesies dengan cepat & efisien
-seluruh proses (isolasi DNAdokumentasi) dilakukan < 24 jam
-tidak memerlukan bahan kimia berbahaya
-memungkinkan memproses sampel secara serentak

Single-Step PCR for

Detection of Brucella spp.
From Blood and Milk of
Infected Animals
Journal of Clinical Mikrobiology,
Dec 1995,p 3087-3090

Latar Belakang
Brucellosis disebabkan oleh bakteri gram negatif
yang termasuk genus Brucella
B. melitensis
penyebab utama brucellosis
pada kambing dan manusia di Mexico
Setelah periode akut
patogen ini
bersembunyi di cairan tubuh mahluk yang telah
terinfeksi
darah dan susu
Deteksi
secara serologi dan mikrobiologi
kurang sensitif dan spesifik
perlu
dikembangkan metode baru
PCR

Tujuan
Membuktikan kemampuan,tingkat kesensitifan
dan tingkat kespesifikan dari Single-Step PCR
untuk mendeteksi darah, susu pada kambing
dan manusia yang terinfeksi Brucella spp.
Membandingkan hasil Single-Step PCR dengan
uji serelogi dan analisa mikrobiologi untuk
mendeteksi darah, susu pada kambing dan
manusia yang terinfeksi Brucella spp.

Cara Kerja
Persiapan sampel
Sampel positif

strain Brucella spp.

kambing yang terinfeksi
pasien brucellosis
Sampel negatif
strain bakteri yang
memiliki hubungan dengan Brucella
spp.ekstrak DNA dari manusia, kambing dan
sapi yang belum pernah divaksin,dinyatakan
bebas Brucella spp. setelah melakukan uji
serologi dan analisa mikrobiologi

 Uji Serologi
9 ml darah (kambing,sapi,manusia yang terinfeksi)
Dibagi dalam 3 aliquot
3 ml tidak ditambah dengan antikoagulan
Dilakukan uji fiksasi

 Analisa Mikrobiologi
3 ml darah yang mengandung antikoagulan
dikultur dalam medium Ruiz-Castaneda Biphasic,
posisi vertikal pada suhu 37C
Darah yang ada dalam aliquot
ditanam pada
agar standrad untuk pertumbuhanBrucella spp.selama
3 minggu
Lapisan lemak bagian atas susu
ditanam pada
agar untuk pertumbuhan Brucella spp. yang
mengandung antibiotik
diinkubasi pada suhu
37C dalam kondisi aerobik

 Single-Step PCR
Ekstraksi DNA dari darah
Design oligonukleotida sintetik
(sequen DNA yang digunakan berasal dari gen yang mengkodeprotein
membran luar (omp 2)untuk B. abortus)

PCR
Analisis komputer

Tabel. Spesies dan biovar yang digunakan

Gambar. Peta amplifikasi gen omp 2 dengan primer

JPF,JPR dan DNA Brucella

Tabel. Hasil deteksi Brucella sp dengan berbagai

metode

Kesimpulan
Metode Single-Step PCR mempunyai
kesensitifan dan kespesifikan yang tinggi
Metode Single-Step PCR lebih sensitif dan
spesifik dibandingkan dengan uji serologi
dan analisa mikrobiologi untuk mendeteksi
darah ,susu pada kambing dan manusia
yang terinfeksi Brucella spp