Anticuerpos

Monoclonales
Diseo, Obtencin,
Produccin y
Purificacin.

Cultivo celular

En suspensin: Linfocitos
Adherentes: Hela

Inmortalizada
(lnea celular
establecida)
Sometida a
estmulos
proliferativos
(Mitgenos)
Sometida a
txicos
Sin inmortalizar
Sin estmulo
proliferativo

Esterilidad

H20
Temperatura

Nutrientes

37C

pH
fisiolgico

Oxgeno

Factores
de
crecimiento

H20
Nutrientes

Medio
de
Cultiv
o

pH
fisiolgico

+
SFB
Factores
de
crecimiento

Esterilidad

Glucosa
Aminocidos
(20)
Vitaminas (B12,
biotina,
riboflavina, Ac.
Flico, etc)
Minerales
(Ca2+ ClNa, K+,
Mg2+, etc)
Indicador de
pH (Rojo fenol)
Buffer

Esterilidad

Oxgeno
Ventilacin

Esterilidad

Temperatura
37C

Esterilidad

Mtodos de Obtencin de
AcMo I

Mtodo tradicional: tcnica de hibrido

Pasos:
1. Inmunizacin de los
animales
2. Extraccin del bazo del
animal inmunizado (en
esterilidad).
3. Fusin de los esplenocitos y
las clulas de mieloma.
4. Seleccin postfusional por
medio HAT.
5. Aislamiento o Clonado
biolgico.
6. Screening para anticuerpos
especficos
7. Nuevo Aislamiento o
Clonado biolgico.
8. Nuevo screening para
anticuerpos especficos

1 Inmunizacin del
animal
Ratones BALB/c Buena respuesta
orientada a Th2
Segn el antgeno que se utilice ser el
protocolo de inmunizacin
(va, tiempo interdosis, cantidad de
inoculaciones, masa y concentracin
del inmungeno, utilizacin o no de
adyuvantes, etc)
Objetivo: obtencin de un bazo
enriquecido en clones de linfocitos B
especficos para la proteina de inters.

2 - Extraccin del Bazo

Asepsia medios sin

antimicticos

Recuperacin utilizacin de
potter

Tiempo viabilidad

Clulas de Mieloma

( Ej.

NS0)

Clulas no productoras de Ac
Genticamente modificada deficiencia de
HGPRT (hipoxantil guanil fosforribosil
transferasa) incapacidad de sntesis de
purinas a partir de hipoxantina o guanina
(caracterstica utilizada para la posterior
seleccin)

3 - Fusin

Mezcla de la suspensin de
esplenocitos con la de las clulas
de mieloma en presencia de un
agente fusionante (PEG 1500)

El PEG fusiona membranas por

perturbacin de las estructuras
de bicapa lipdica pero es txico.

4 Cultivo selectivo

Medio de cultivo selectivo HAT

(Hipoxantina-Aminopterina-Timidina, donde la Aminopterina acta

inhibiendo la sntesis de novo de purinas)

1.esplenocito-esplenocito (HGPRT +)

Fusi
n

2.NS0-NS0 (HGPRT -)
3.esplenocito-NS0 (HGPRT +)

5 1 Screening
er

Depende de la finalidad del AcMo

Generalmente por ELISA del
sobrenadante de cultivo
Conjugado
Anticuerpos
del
sobrenadant
e Antgeno

6 - Clonado

Por dilucin Lmite (mtodo de

eleccin)

Por medio semislido (similar al

agar para bacterias)

7 2do Screening
Se realiza en general con el mismo ELISA del paso

8 Amplificacin del
cultivo

Hay metodologas industriales para produccin de

grandes volmenes y de laboratorio con el uso de rato
produccin de lquido asctico.

Produccin de AcMo I
Mtodo in vivo Ascitis murina
1.

2.
3.

4.
5.

Sensibilizacin de los ratones pristane

/ adyuvante de Freund incompleto
Cultivo del hibridoma monoclonal
Inoculacin de las clulas
intraperitonealmente
Drenado del lquido asctico
Clarificacin de la ascitis

Produccin de AcMo II
Mtodos in vitro
Cultivo de 2 compartimentos
Cultivo de 2 compartimentos rotatorio
Cultivo en biorreactores de fibra
hueca

Frascos de 2
compartimentos
Estacionarios

Rotatorios

Biorreactor de fibras
huecas

Purificacin
Esquema General

Enriquecimiento por precipitacin con

SO4(NH4)2 al 50% o 30% de saturacin
Paso por resinas de intercambio inico
dbil (DEAE) o fuerte (Mono Q S).
Uso resinas de afinidad.
Se hace el seguimiento por PAGE.

Anticuerpos humanizados y
qumricos

Nimotuzumab
Anti-EGFR
(Rc. factor de recimiento
epidrmico)
Fase III

Cncer de pulmn,
pncreas, colorectal y
esfago, adems de
glioma