DIAGNOSTICO VIRAL

Diagnstico viral
Para qu sirve Dx virolgico?
Dependiendo del caso
Determinar una intervencin teraputica : tto en queratitis o

encefalitis herptica, rabia, cesrea en herpes genital. para enfermedades

graves por virus en: Terapias agresivas (cancer), transplantados, sida.

Definir el pronstico en la evolucin de un paciente o indicar la

necesidad de una vacunacin: valor del dato negativo (rabia, rubeola y
embarazo, infecc. Congnitas)

Epidemiolgicamente sirve para adoptar medidas de salud pblica en

una comunidad. Vigilancia epidemiolgica: incidencia de enfermedades como SIDA,
hepatitis, arbovirus, cepas circulantes de virus influenza.

Desarrollo de nuevas tcnicas diagnsticas.

Mas asequibles
Tcnicas moleculares

METODOSDIRECTOS
1.Elviruscomoagenteinfeccioso(aislamiento
viral).
2.Elviruscomopartcula(microscopa electrnica).
3.Lapresenciadeantgenosvirales (tcnicas
inmunolgicas): Inmunofluorescencia (IF),
Enzimoinmunoanlisis (EIA), Test de Aglutinacin.
4.Lapresenciadecidosnucleicosvirales
(genomas):tcnicasdehibridacinmolecular:
PCR,etc

Mtodos directos
A. Deteccindirecta

Elviruscomopartcula

Microscopaelectrnica:Coronavirus, Rotavirus,
Hepatitis A, Adenovirus, Orthomixovirus (Heces, Moco,
otros)

Inmunoelectromicroscopa:concentradosde
complejos Ag-Ac : Hepatitis A, Parvovirus (Heces)

Inmunofluorescencia:Rabia, Virus Epstein Barr

(Tejidos fijados o congelados )

Lapresenciadeantgenosvirales:

ELISA,Captura de antgeno: Hepatitis B

Aglutinacindelatex:Partculas latex cubiertas de Acs:

Rotavirus

Inmunofluorescencia(IF),

InmunoperoxidasaIPyPAPprueba
inmunohistoqumica

Microscopa electrnica
Heces(diarrea)
mltiples agentes:
Adenovirus y
rotavirus

Inmunoelectromicroscopa
Parvovirus B 19

Inmunofluorescencia

Mtodos directos
B.Aislamiento
Animales de laboratorio
Huevos embrionados (Hemoaglutinacin, liq. Amnitico
o alant)
Cultivos celulares:
o Cultivos primarios
o cultivos diploides
o lneas continuas: Renales de mono RhMK,Fibroblastos
pulmn humano MRC-5,Carcinoma epidrmico humano
Hep-2,Carcinoma de crvix HeLa,Carcinoma pulmonar
humano A549,Rin de hmster lactante BHK.

Cuando 50% de monocapa presenta ECPse puede

analizar por: IF, Hemadsorcin, ensayos de
Interferencia, PCR y ensayos para detectar actividad
enzimtica especfica (la transcriptasa reversa)

Coleccin y transporte de las

muestras
Deben ser adecuadas y en el momento oportuno,
dependiendo de la infeccin y etiologa viral
Aspirados, lquidos y tejidos: recipientes estriles
hermticos a prueba de derrames.
Medio de transporte: hisopados de piel, tracto
genital, esputo, aspirados nasofarngeos, heces..
- antibiticos y antimicticos (inhibir flora) y sustancias
proteicas (albmina o suero fetal bovino), para preservar
al virus

Sin medio viral de transporte: sangre

Tubos conteniendo muestra, en recipientes con hielo
granizado mas sal.
Muestras no deben congelarse. (excepto grandes
distancias; hielo seco)

Cmara
de aire

Membrana
corioalantoidea
Cascaron

Cavidad
amnitica

Saco vitelino

Membrana
del cascarn

Albmina

Cavidad
alantoidea

CULTIVOS CELULARES

BS-C-1 (clulas de rin de mono)

Virus de la vacuna

Redondeamiento y
desprendimiento de las clulas

Hemadsorcin de eritrocitos de mono a

clulas infectadas por el virus del sarampin
(centro de la fotografa)

Deteccin de antgeno

Deteccintemprana:

Combinacin de cultivo celular y la

centrifugacin, (Ags virales, antes de ECP) uso
de Shellvial

Mezcla de lneas celulares: clulas de pulmn

de visn Mv1Luy clulas de adenocarcinoma
humano A549en el mismo tubo.
Almacenamiento de los cultivos mixtos a -80
C hasta 4 meses.
FreshCells*,R-Mix*

Diseo de cultivos celulares por ingeniera

gentica.
enterovirus:

la lnea de rin de mono verde bfalo

BGMK las que expresan un receptor
HSV: mediante sistema enzimtico inducible por virus
(enzime-linked virus-inducible system: ELVIS) (: BHK
rion de mono lactante con un gen clonado para unin a
la B-galactosidasa. El desarrollo del HSV da como
resultado la produccin de B-galactosidasa por las clulas
BHK. La B-galactosidasa funciona como molcula
indicadora, cuando las clulas se fijan y tien para
buscar actividad de galactosidasa una tincion positiva
indica presencia de HSV-1 o HSV-2 (cambio de color de la
monocapa).

Deteccin de antgeno en cultivos celulares

Inmunoperoxidasa IP Y PAP
Cocultivo de clulas H&V(renales mono verde+
fibroblastos humanos)

Deteccin de Ag por Inmunocromatografa

Tiene las ventajas de su simplicidad y rapidez, (VIH).
Migracin de una muestra a travs de una
membrana de nitrocelulosa

 Moleculares: ADN o ARN viral

PCR convencional
Multiplex PCR
Transcripcin reversa RT-PCR
Real time PCR (RT-PCR): virus ADN y
ARN
Dot Blot, Slot Blot, Southern Blot,
Northern Blot
Microarrays

ReaccinenCadenadela
Polimerasa(PCR)
1983 Ideada por Dr.KaryMullis.
1985 Aparece en Science la 1 publicacin sobre
PCR.
1986 Se usa por 1 vez Taqpolimerasapurificada
en vez de Klenow.
1988 Science publica la primera descripcin de una
PCR con una polimerasa termoestable.
1991 Se desarrolla la RT-PCR usando una sola
polimerasa termoestable, rTth, facilitando los test
para los virus de RNA.
1993 Se le otorga el Premio Nobel de Qumica a
Kary Mullis por el desarrollo de la tcnica de la PCR.

ProblemasenlaPCR
Problemasmscomunes:
Demasiados amplificados, inespecificidad,
dmeros de primers
Contaminaciones
No deteccin de producto de amplificado o
poco rendimiento

(Q-PCR)

Deteccin de de cidos nucleicos

virales: uso de sondas
Deteccin de genomasviralesmediante hibridacin lo
cual permite una muy alta especificidad y elevada
sensibilidad, y con disponibilidad de reactivos
estandarizados.
Se fundamenta en la tendencia de dos cadenas de cido
nucleico a aparearse y desarrollarse por sus secuencias
nucleotdicas complementarias formando una doble hlice.
Por eso es necesario separar previamente las dos cadenas
de la doble hlice a hibridar
La longitud mnima de secuencias de ADN perfectamente
complementarias que pueden reconocerse y formar
hbridos estables es del orden de los 12nucletidos, y
pueden ser detectados si una de las cadenas esta
marcada con material radioactivo u otras marcas

Esta tcnica se sigue con xito:

Para evidenciar la presencia de papilomavirus en
biopsias o raspados cervicales.
Demostracin in situ de cantidades pequeas de
virus de la hepatitis B, virus Epstein Barr (EBV),
HSV tipo I, CMV, ADV y rotavirus. Se dispone de
estuches comerciales de sondas para el
descubrimiento de CMV, HSV y ADV5,17,18. y para
los virus de hepatitis A, B y C
Para identificar las secuencias complementarias del
virus de hepatitis E.
Identificar el parvovirus B19 en suero, en
leucocitos, en secreciones respiratorias, en orina y
tejidos.

Por hibridacin de cidos nucleicos se entiende la

construccin de un cido nucleico de doble cadena
a travs de un proceso por el cual dos cadenas
sencillas y de distinto origen de DNA, de RNA o una
de RNA y otra de DNA se unen mediante la formacin
de puentes de hidrgeno entre las bases de citosinaguanina y adenina-timina (o adenina-uracilo).
La mlecula de cadena doble as formada se llama
HIBRIDO.

Tcnicasdehibridacin
DotBlot

ARN o ADN parcialmente purificadode la muestra

problema, se siembra sobre filtro de nitrocelulosa y
nylon luego se fija por calor o radiacin UV, luego se
realiza la hibridacin con la sonda marcada
SlotBlot

Aplicacin del cido nucleico en el filtro a travs de

pequeas ranuras
NorthernBlot

Fraccionamiento electrofortico de ARN en gel y su

trasferencia a filtros, la sonda es ADN o ARN
SouthernBlot

ADN tratado con endonucleasas de restriccin y

fraccionado mediante electroforesis en gel y trasferidos
a filtros por difusin capilar y luego fijados, la sonda es
ADN o ARN

Extraccin de DNA
genomico

comprobacin

Cultivo de noche de un
plsmido con el inserto que
har de sonda

comprobacin

Extraccin del plsnido

por lisis alcalina

Digestin con un
enzima de restriccin
Electroforesis de
transferencia

comprobacin

Fotografa del gel

comprobacin

Digestin con una

enzima de restriccin

Desproteinizacin
comprobacin

Desnaturalizacin

Neutralizacin

Marcaje random
priming con
digoxigenina-D-dUTP

TRANSFERENCI
A AL FLITRO

Lavado de la sonda
Transferencia
comprobacin
SONDA PREPARADA

Fijacin del DNA al

filtro (nitrocelulosa:
calor) (nylon:
irradiacin)

DESNATURALIZACIN DE
LA SONDA

FILTRO PREPARADO
PARA HIBRIDAR
Prehibridacin

Hibridacin

Lavados

Relavado
del filtro

VISUALIZACIN
DEL FILTRO

HIBRIDACIN
SOUTHERN

ADN
- PRODUCTO DE P.C.R.
- FRAGMENTOS DE
RESTRICCIN

Kg

PAPEL TOALLA

PAPAEL FILTRO
NYLON DE
NITROCELULOSA

GEL DE
AGAROSA

Papel filtro

encia
Bufer de transfer

1. ELECTROFORESIS

2. TRANSFERENCIA

HIBRIDACIN
SOUTHERN
NYLON + ADN

5. LAVADOS
DE
RIGUROSIDAD

4. HIBRIDACIN

3. PREHIBRIDACIN

Film radiografico

NYLO
N

Film adherente

7. REVELADO
6. DETECCIN

Cassette
radiografico

Microarray con anticuerpos: Patgenos

emergentes: corona(dx) y hanta (identificar)

Microarray con anticuerpos

USO DE SONDAS PARA

DETECCIN DE CIDOS
NUCLEICOS VIRALES
Sistema
detector
(colorante
)
Fosfatasa
alcalina

Fosfatasa
alcalina
Anticuerpo antidigoxigenina

Hapteno de
digoxigenina

Secuencia blanco
de ADN o ARN

Sonda no radioactiva
marcada con
digoxigenina
SONDA

Sonda radioactiva marcada con 32P

Sistema
detector
(autorradio
grafa)
32P

32P
Sonda

Secuencia blanco de ADN o ARN

 En los estudios de microarrays se combinan las

tcnicas de hibridizacin de cidos nucleicos y
deteccin por fluorescencia. De esta manera, slo en
los puntos del portaobjeto donde haya ocurrido
hibridizacin habr fluorescencia y la intensidad de la
fluorescencia detectada ser proporcional al nivel de
expresin del gen en estudio.
Las sondas son anticuerpos fijados a portaobjetos de
vidrio y los blancos son muestras de suero o tejido.
Esta tcnica se ve por el momento restringida por
varios puntos que requieren de tiempo para
esclarecerse. Entre ellos podemos mencionar la
dificultad de fabricar e inmovilizar estructuras 3-D
como son las protenas y detectar interacciones de
protenas plegadas, sin olvidar mencionar que no se
dispone an de colorantes fluorescentes que
permitan cuantificar eficientemente a estas
molculas.

Mtodosindirectoso
serolgicos

Infecciones agudas: IgM, seroconversin

Infecciones crnicas: IgG
FC fijacin del complemento
Neutralizacin
Inhibicin de la Hemoaglutinacin IHA
Inmunofluorescencia indirecta
Enzimoinmunoensayo ELISA
Western blot
Radioinmunoensayo RIA

PRUEBAS SEROLGICAS.
Enzimoinminoanlisis de absorcin ELISA
Ag unido a fase slida
+
Suero

Lavado

+
Anti-Ac*
Lavado
+
Sustrato

ELISA
ELISA
Plac
a

Antgen
o
Pocillo

Anticuerp
o

Enzima
Anticuerpo
marcado
Substrato
Producto
coloreado

TEST DE FIJACIN DEL COMPLEMENTO

TEST NEGATIVO

Aadir antgeno

Aadir complemento

Aadir hemates-Ac.

Suero sin
anticuerpos

No formacin
de complejos

Complemento
libre

Clulas rojas
lisadas

TEST DE FIJACIN DEL COMPLEMENTO

TEST POSITIVO

Aadir
antgeno

Aadir
complemento

Aadir hemates-Ac.

Suero con
anticuerpos

Formacin
de complejos

Fijacin del
complemento

Clulas rojas
ntegras

INMUNOFLUORESCENCIA
Directa
Colorante
fluorescente
Anticuerpo

Antgeno

Superficie celular

INMUNOFLUORESCENCIA
Indirecta
Anticuerpo

Colorante
fluorescente
Superficie celular

Anticuerpo
anti Ac.
original

Superficie celular

Western blot