Universidade Federal do Rio Grande

Faculdade de Medicina
Histologia

Cell-Engineered Human Elastic Chondrocytes Regenerate

Natural Scaffold In Vitro and Neocartilage with
Neoperichondrium in the Human Body Post-Transplantation
Hiroko Yanaga, Keisuke Imai, Mika Koga, e Katsu Yanaga.
TISSUE ENGINEERING: Part A
Volume 18, Numbers 19 and 20, 2012
Mary Ann Liebert, Inc.
DOI: 10.1089/ten.tea.2011.0370

Introduo

Testes at ento:
Monocamadas (in vitro).

Problemas:
No mantm integridade do tecido aps transplante;
Condrcitos so absorvidos aps transplante.

Introduo

Necessidade:
Muitos condrcitos;
Organizados em multicamadas.

Inovao:

FGF-2 (fator de crescimento de fibroblastos 2);

Camadas so sobrepostas;
Obteno de grande quantidade de condrcitos;
Impedimento de disperso, concentrao;
Em multicamadas, dificulta-se a absoro ps-transplante.

Introduo
2 mtodos:
Fase nica: injeo de transplante;
2 estgios de transplante.

2 estgios:
1 fase: formao de neocartilagem e neopericndrio intraabdominal (6 meses).
2 fase: implante no tecido alvo.

Objetivos
Demonstrar que com FGF-2 h produo de cido
hialurnico - AH e a formao de um andaime in
vitro.
O AH se liga ao agrecano, proteoglicano cartilaginoso
componente da matriz extracelular MEC.
Demonstrar que no mtodo de 2 estgios h a
regenerao de neocartilagem e neopericndrio aps 6
meses de implantao intra-abdominal.

Materiais e Mtodos
Fontes de tecido cartilaginoso:
Reminiscncia de cartilagem auricular em cirurgias de
correo de microtia humana;

http://benplaa03.blogspot.com.br/

http://virtualmentor.ama-assn.org/2010/05/cprl1-

Materiais e Mtodos
Sistema de cultura de vrias camadas

Problema
Restos de cartilagem auricular;
Tratadas com 0,3% de colagenase;
Amostras agitadas por 4h, 37C;
Filtradas em clula peneira poro de 100m;
Isolamento de clulas.

Materiais e Mtodos
Sistema de cultura de vrias camadas
Clulas obtidas foram semeadas a uma densidade de
1 x 103 clulas/cm;
Resultou em 1.000 vezes mais clulas que cultura primria;
Estas foram semeadas em monocamadas de 2 x 10 4
clulas/cm;
Clulas semeadas 3 vezes em cima das previamente
cultivadas;
Processo se deu a cada 7 dias.

Materiais e Mtodos
Sistema de cultura de vrias camadas
densidade de 2 x 104 clulas/cm so inoculadas com um
total de 3 x 106 clulas/25mL em um frasco de 150 cm;
O processo repetido uma semana mais tarde num frasco de
150 cm;
Quantidade muito grande condrcitos so adquiridas com este
mtodo;
Trinta frascos de 150 cm de culturas multicamadas so usadas
por transplante em nica reconstruo de orelha.

Materiais e Mtodos

Meios de cultura

F-12;
DME;
Autoserum 10%*;
FGF-2, 10ng/mL;

* O soro obtido a partir de sangue do prprio paciente e utilizado em

autoseroterapia. (http://www.encyclo.co.uk/define/autoserum&prev=/
search%3Fq%3Dautoserum%26hl%3Dpt%26safe%3Doff%26bi
w%3D1600%26bih%3D775&sa=X&ei=53pbUZ3YA-qE0QGjkIDoD
w&ved=0CEwQ7gEwBA
)

Materiais e Mtodos
Meios de cultura
Penicilina G;
Sulfato de estreptomicina;
Anfotericina B, 2,5mg/mL;

FGF-2, no Japo, j era utilizado como cicatrizador de

feridas.

Materiais e Mtodos
Ensaio de medio de AH
Mtodo de aglutinao de ltex;
Ltex adicionado ao meio;
Absorvncia de 800nm (Hitachi7170S; Tquio), concentrao
de AH.

Materiais e Mtodos
Transplante
Condrcitos multicamadas foram coletados e introduzidos
com uma seringa numa bolsa subcutnea da parede abdominal
inferior (4 semanas da cultura primria);
Decorreram 6 meses;
Retirado cirurgicamente um bloco de neocartilagem e
reimplantado no mesmo paciente para correo de microtia.

Materiais e Mtodos
Anlise histolgica e imuno-histoqumica

Bloco de neopericndrio aps 6 meses de transplante;

10% formalina tamponada neutra;
Embebido em parafina;
Corados com hematoxilina e eosina, azul de toluidina e
Elastica Van Gieson (EVG).

Materiais e Mtodos
Anlise histolgica e imuno-histoqumica
Imuno-histoqumica confirmou presena de colgenos tipo I e II.
Soluo de anticorpos humanos de colgeno tipo I, (Southern
Biotech);
Soluo de anticorpos humanos de colgeno tipo II, (Chemicon
Internacional).
40mg de anticorpos / 100mL
Anlise de varredura em microscopia eletrnica.

Materiais e Mtodos

Clculo de tan delta (caractersticas de resistncia do material) por meio

da anlise dinmico-mecnica (DMA)
Anlises de caractersticas viscoelsticas de cartilagem auricular elstica,
cartilagem costal hialina e neocartilagem viscoelstica.

Como no um modo destrutivo de anlise, o mesmo material pode ser

analisado vrias vezes.
Anlises estatsticas.

Resultados
Obteno de clulas condrognicas;
Sob ao de FGF-2 aumento de 3 vezes;
Com isso comprovou-se o envolvimento do FGF-2 na
proliferao dos condrcitos elsticos;
AH aumentou consideravelmente em relao cultura
controle;
AH aumentou mais na cultura multicamada que na
monocamada.

Resultados
in vitro

Monocamada

Diferenciao para clulas

fibroblsticas planas;
Fentipo perdido.

Multicamada
Sobreposio celular;
Conexo de protuberncias
intercelulares;
Fentipo de condrcito.

(a) Tringulos vermelhos:

Condrcitos ligados uns
aos outros (rede);

(b) Maior aumento de (a);

(c) Tringulos vermelhos:

sobreposio de
condrcitos criando rede;

(d) Tringulos verdes:

vesculas de matriz e setas
amarelas: microfibrilas.

Resultados
in vivo
Multicamada
Regenerao de neocartilagem;
Formando bloco de neopericndrio;
No houve adeso aos tecidos adjacentes, podendo ser colhida
como bloco nico;
Cor branca brilhante (caracterstico de cartilagem) rodeado
por neopericndrio.

Resultados
Metacromasia azul de toluidina
Presena de agrecano (proteoglicano);
Presena de colgeno tipo II, que comprova a formao de
cartilagem humana;
Presena de colgeno tipo I, que comprova a formao de
pericndrio humano;

Resultados
Colorao Elastica Van Gieson
Presena de fibras elsticas, em quantidade que comprova que
o bloco formado de cartilagem elstica;

Resultados somados comprovam que o bloco era de

cartilagem auricular com condrcitos com diferenciao
normal aps a injeo e transplante.

Resultados
Colorao com azul de toluidina revela que
neocartilagem produziu uma
grande
quantidade de agrecano.

Elastica Van Gieson revelou que

neocartilagem continha fibras elsticas.

Resultados

Neocartilagem contendo colgeno de tipo II.

Cartilagem auricular elstica humana

contendo colgeno tipo II.

Resultados

Neopericndrio contendo colgeno tipo I.

Pericndrio humano contendo colgeno tipo I.

Resultados
Avaliao mecnica da neocartilagem (viscoelasticidade)
Neocartilagem

< cartilagem costal;

Neocartilagem

= cartilagem auricular natural.

Aplicao clnica

12 casos utilizaram esta tcnica de engenharia celular;

100% de casos com resultados satisfatrios;
Em 6 anos de observao ps operatria, no ocorreu
absoro da cartilagem reconstruda.

Discusso

Naturalmente, com o envelhecimento, condrcitos no

interior da matriz e condrcitos maduros perdem a
capacidade de proliferao.
Vrias pesquisas com cultura celular j foram feitas,
mas com resultados de replicao pequeno, o que
inviabilizava um tratamento clnico promissor.

Discusso

Tentativas anteriores:

cido poliltico PLA (andaimes);

cido poligliclico PGA;
Copolmero aginato PLGA;
Gel de agarose;
Biomateriais de andaimes (colgeno, quitosano, fibrina e AH32-38).

Tentativas sem sucesso, mas importantes para que se

vislumbrasse o caminho percorrido pelo trabalho em anlise.

Discusso

Por que aplicaes clnicas anteriores no tiveram sucesso?

O trabalho atual:
Sem andaimes artificiais;
Proliferao com adio de FGF-2;
Engenharia celular: andaime natural.

Maior contagem de clulas com adio de FGF-2;

Mais AH.

Discusso
Outras vantagens:
Em multicamadas, os condrcitos produzem MEC;
Produzem AH;
Induzem rediferenciao de condrcitos;
Projetaram salincias e ligaram-se uns aos outros.

Discusso

Diferenas (MEC):
Monocamada X Multicamada
sem MEC
com MEC

Discusso
Confirmadas in vivo:
Presena de colgeno humano tipo II;
Fibras elsticas;

Confirmadas in vitro:
Induo de diferenciao;
Presena de colgeno tipo I no neopericndrio tal qual no
pericndrio auricular.

Discusso
Teste viscoelasticidade:
Neocartilagem

< cartilagem costal;

Neocartilagem

= cartilagem auricular nativa.

Discusso
2 estgios:
Regeneram MEC;
Desenvolvem neocartilagem com neopericndrio in vivo;

Otimismo para aplicaes clnicas:

12 pacientes tratados com sucesso;
Evita repeties de cirurgias (menor absoro de condrcitos).

Referncias

http://benplaa03.blogspot.com.br/
http://virtualmentor.ama-assn.org/2010/05/cprl1-1005.html
http://www.encyclo.co.uk/define/autoserum&prev=/sear
ch%3Fq%3Dautoserum%26hl%3Dpt%26safe%3Doff%26biw%3D16
00%26bih%3D775&sa=X&ei=53pbUZ3YA-qE0QGjkIDoDw&ved=0C
EwQ7gEwBA

MUITO
OBRIGADO!!!