Beruflich Dokumente
Kultur Dokumente
CH3
5---- GAATTC ---- 3
3---- CTTAAG ---- 5
CH3
M.EcoRI
R.EcoRI
CH3
5---- GAATTC ---- 3
3---- CTTAAG ---- 5
CH3
5---- G
AATTC ---- 3
3---- CTTAA
G ---- 5
Caso 1
EcoRI
HindIII
Lisis
Bacteria EcoRI+ HindIII-
Caso 2
No hay lisis
Bacteria EcoRI- HindIII+
CH3
Caso 3
EcoRI
HindIII
No hay lisis
3
Bacteria EcoRI+ HindIII-
m5
MrcBC:
Pum5CG
Mrr:
CG
m6
Clasificacin de ER
Composicin de las subunidades
Especificidad de la secuencia de reconocimiento
Sitio de clivaje
Requerimiento de cofactores
Clasificacin de ER
ER
Tipo I
Tipo II
Tipo IIs
Tipo III
Estructura
proteica
Bifuncional, 3
subunidades
Unifuncional,
endonucleasa y
metilasa en
enzimas
separadas
Unifuncional,
endonucleasa y
metilasa en
enzimas
separadas
Bifuncional, 2
subunidades
distintas
Sitio de
reconocimiento
Asimtrico y
bipartito
Secuencia
palindrmica
(simtrica),
Asimtrico y
continuo
Asimtrico,
4-6 pb (tb de
8pb)
Sitio de clivaje
No especfico
1000pb del
sitio de
reconocimiento
Requerimientos
Ejemplo
Uso en biologa
molecular
ATP para
moverse del
sitio de
reconocimiento
al de clivaje,
Mg2+, SAM
EcoKI
En el mismo sitio
de
reconocimiento
o adyacente a
este
No ATP
Mg2+, (la M
requiere SAM)
EcoRI
A distancias
fijas del sitio
de
reconocimiento
(fuera del
mismo)
Mg2+, (la M
requiere SAM)
No ATP
AwlI
5-7 pb.
R: secuencia
duplicada en
direcciones
opuestos
24-26 pb ro
abajo del sitio
de
reconocimiento
ATP para
moverse del
sitio de
reconocimiento
al de clivaje,
Mg2+, SAM
EcoP15
AACN6GTGC
CAGCAG(N)CTGCTG
TTGN6CACG
GTCGTC(N)GACGAC
No generan
fragmentos de
tamao
definido
Generan
fragmentos de
tamao definido,
se usan en el
laboratorio!!!
Generan
fragmentos de
tamao definido
No generan
fragmentos de
tamao definido
Extremos:
Romos:
5----CCCGGG ---- 3
3----GGGCCC ---- 5
SmaI
5----CCC
3----GGG
GGG ---- 3
CCC ---- 5
Cohesivos:
5 protruyente
5---- GAATTC ---- 3
3---- CTTAAG ---- 5
EcoRI
5---- G
AATTC ---- 3
3---- CTTAA
G ---- 5
3 protruyente
5---- CTGCAG ---- 3
3---- GACGTC ---- 5
PstI
5----CTGCA
3----G
G ---- 3
ACGTC ---- 5
Isoesquizmeros:
Son distintas ER que reconocen la misma secuencia, generalmente con
distintas especificidades. Pueden generar:
los mismos extremos: Acc65I y KpnI
5----G
GTACC ---- 3
3----CCATG
G ---- 5
5----GGTACC ---- 3
3----CCATGG ---- 5
distintos extremos:
5----CCCGGG ---- 3
3----GGGCCC ---- 5
5----CCCGGG ---- 3
3----GGGCCC ---- 5
SmaI
XmaI
5----CCC
3----GGG
GGG ---- 3
CCC ---- 5
5----C
CCGGG ---- 3
3----GGGCC
C ---- 5
5----AGATCT ---- 3
3----TCTAGA ---- 5
BamHI
BglII
5----G
GATCC ---- 3
3----CCTAG
G ---- 5
5----A
GATCT ---- 3
3----TCTAG
A ---- 5
EcoRI
5---- G
AATTC ---- 3
3---- CTTAA
G ---- 5
ligasa
5---- GAATTAATTC ---- 3
3---- CTTAATTAAG ---- 5
5---- GAATT
3---- CTTAA
AATTC ---- 3
TTAAG ---- 5
XmnI (GAANN/NNTTC)
PstI
5----CTGCA
3----G
G ---- 3
ACGTC ---- 5
3-5exonucleasa
5----C
3----G
G ---- 3
C ---- 5
5----GGATCT---- 3
3----CCTAGA ---- 5
5----G
GATCC ---- 3
3----CCTAG
G ---- 5
Ligasa
BglII
5----A
GATCT ---- 3
3----TCTAG
A ---- 5
5----AGATCC ---- 3
3----TCTAGG ---- 5
MboI (/GATC)
3- Ligacin de extremos romos:
AluI
5----AG
3----TC
EcoRV 5----GAT
3----CTA
CT---- 3
GA---- 5
ATC---- 3
TAG---- 5
5----AGATC---- 3
3----TCTAG---- 5
Ligasa
MboI (/GATC)
5----GATCT---- 3
3----CTAGA---- 5
11
Usos en el laboratorio
Generar fragmentos de DNA de tamao definido para:
generar molculas recombinantes: clonado
NcoI
NcoI
HindIII
HindIII
Digestin con
ER
Fragmento
amplificado
p
Yep51
Ligacin
Digestin
con
HindIII
12
2) Reaccin de digestin
DNA (1 g) libre de contaminantes
Buffer de reaccin (1X)
(viene 10X)
ER (1 l= 10U)
pH (Tris-Cl)
sales (NaCl o KCl) =Fi
cofactores (Mg2+)
BSA
mantener en fro
ltima en ser agregada
glicerol < 5% v/v
1UE: cantidad de enzima que corta
completamente 1 g de DNA del fago
lambda en un volumen de 50 l en 1 hs
usando el buffer correspondiente
13
Actividad STAR:
Algunas enzimas (en condiciones de reaccin que no son las ptimas) pueden
producir cortes en secuencias que son similares a sus secuencias de corte.
Ejemplo:
EcoRI en condiciones ptimas cliva:
5 G/AATTC 3
en condiciones no ptimas puede clivar:
5 N/AATTN 3
Condiciones que contribuyen a la actividad STAR
1- glicerol [>5% v/v]
2- alta UE/ g of DNA (>100 UE/g)
3- baja Fi [<25 mM]
4- alto pH [>pH 8.0]
5- sv orgnicos (DMSO, etanol)
6- sustitucin de Mg++ por otros cationes divalentes (Mn++, Cu++, Co++, Zn++)
7- tiempo de incubacin mayor al ptimo
8- fragmento de DNA amplificado por PCR, sin previa purificacin del mismo
Cmo inhibir la actividad STAR
1- mn UE (digestin completa)
2- DNA libre de contaminantes
3- aumentar Fi 100-150 mM
4- pH 7.0.
5- Mg++
14
15
Secuencia a digerir:
Existen programas en internet en los cuales uno puede introducir la
secuencia de bases completa simple cadena y obtener el MAPA DE
RESTRICCIN. Ejemplo: Neb cutter V2.0
Secuencia del gen BCY1:
16
Digestin doble
Digerir un mismo fragmento de DNA con dos ER distintas. Por ejemplo:
hacer clonado direccional
evitar tener que precipitar al DNA dos veces, lo cual podra resultar
en la prdida de masa de DNA
ahorrar tiempo
A tener en cuenta:
En el vector:
Las secuencias de reconocimiento de las ER a emplear no debern
solaparse, y debern estar a una determinada distancia en pb cuando
se realiza una digestin doble.
Nco
I
17
Digestin doble
Incompatibilidad
digestin secuencial :
18