Analiza fitoplanktonskog sastava

1931 Utermhl: standardna

kvantitativna metoda za
odreivanje brojnosti
fitoplanktona
stavi se 550 ml uzorka u
sedimentacijsku komoru i ostavi
da se slegne
stanice se broje s invertnim
mikroskopom

Omoguava odreivanje detaljnog

fitoplanktonskog sastava i
biomase u ekosustavu

Nedostatak: vrijeme taloenja 24

ili 48 h ovisno o koliini uzorka i
gustoi populacije

Raznolikost strukture toksina

iroki raspon kemijskih struktura: od

visokopolarnih spojeva male
molekulske mase do velikih lipofilnih
molekula

veina toksina je termolabilna

neki su osjetljivi na promjenu pH,

izloenost kisiku i/ili svjetlosti

samo rijetki posjeduju kromofore

Kromofor: skupina koja je

odgovorna za obojenost tvari
apsorbira svjetlost u vidljivom
dijelu spektra

Pokus na mievima (Mouse bioassay, MB)

Bioloka metoda analize

Postupak za DSP:

ekstrakcija DSP toksina iz

hepatopankreasa
homogenizacijom s acetonom

inokulacija u mia vrste Swiss

(teina 15-20 g)

praenje stanja tijekom 24

sata

Tumaenje rezultata po Yassumotu:

vrijeme preivljavanja mia 5

sati: opasno po ljudsko zdravlje

vrijeme preivljavanja mia 24

sata: prisutnost toksina, ali bez
opasnosti po zdravlje ovjeka

Nedostaci

loa reproducibilnost

nemogunost identifikacije
toksina

koritenje ivotinja u
eksperimentalne svrhe

Kemijske metode analize

HPLC
(High Performance Liquid
Chromatography)
visokotlana tekuinska
kromatografija

Analiza (razdvajanje i
identifikacija) toksina u
ekstraktu koljkaa usporedbom
s poznatim standardnim uzorkom

Detektor: apsorpcija u UV
podruju ili fluorescencija

A: rezervoari za otapala
B: mijeanje otapala
C: visokotlana pumpa
D: predkolona
F: injektor
G: kolona

Fluorescencija
pobueno stanje
pobueno
vibracijsko
stanje

osnovno
vibracijsko
stanje

Fluorescencija je pojava kod koje tvar izloena

elektromagnetskom zraenju emitira
elektromagnetsko zraenje vee valne duljine

Fluorescencija nastaje kada foton upadnog zraenja

pobudi elektron u neko pobueno stanje

Svaka molekula pokazuje vibracije koje su

kvantizirane

zelena svjetlost
(niska energija)

plava svjetlost
(visoka energija)

osnovno stanje

pobuivanjem elektrona iz osnovnog stanja,

molekula e se pobuditi u neko pobueno vibracijsko
stanje pobuenog stanja

Molekule u pobuenim vibracijskim stanjima se brzo

(unutar nanosekunde) relaksiraju u osnovno stanje
danog elektronskog stanja neradijativnim putem

Molekule u pobuenom elektronskom stanju, koje se

nau u osnovnom vibracijskom stanju mogu
emitiranjem fotona prijei u osnovno elektronsko
stanje

Fluorescencija traje reda veliine nanosekunde

Kromatografija

Razdvajanje tvari na osnovu razliitih svojstava

pufer
za nanoenje

pufer
za eluiranje

Ion-izmjenjivaka kromatografija
Afinitetna kromatografija
Gel-filtracija
Hidrofobna kromatografija

Koncentracija

smjesa
uzoraka

broj frakcije, ili

volumen otapala

frakcije
7

Derivatizacija

derivatizacija radi uvoenja jakog

fluorescentnog kromofora u
strukturu spoja

analiza fluorescentnim
detektorom (LC-FLD)

PDAM

derivatizacijski agensi:

9-antrildiazometan (ADAM)

pirenildiazometan (PDAM)
diazometan:

sinteza metilestera

U mraku
Sobna temperatura
90 minuta

Retencijsko vrijeme

Retencijsko vrijeme (Rt) je vrijeme (u minutama)

zadravanja spoja u kromatografskoj koloni
Retencijsko vrijeme se usporeuje s retencijskim
vremenom standardnog uzorka
Mogui problem: nedostatak standardnog uzorka

HPLC kolona

kromatogram

injektor

otapalo
(mobilna faza)

uzorak
pumpa

detektor

otpad

Spektrometrija masa
raspriva
tekua pumpa

detektor

Spektar mioglobina

MALDI-TOF

Matrix assisted laser

desorption time of flight
mass spectrometry

Protein fosfatazni test

mjeri se promjena aktivnosti PP-2A

uz razliite metode detekcije:

kolorimetrijska
bioluminiscentna
fluorescentna
Radijacijska

mjeri se promjena koncentracije pNP

p-nitrofenilfosfat (p-NPP) + H 2O
p-nitrofenol (p-NP) + ortofosfat (P i)

PP2A defosforilira p-NPP u p-NP

DTX inhibira PP2A

p-nitrofenol: apsorpcijski
maksimum kod 405 nm
uto obojen
vea koncentracija DTX,
manja apsorpcija