OBTENCIN Y FUNCIN DE

PROTOPLASTOS

QU ES UN PROTOPLASTO?
es parte de la clula vegetal que
est delimitada e incluida dentro de
la pared celular y que puede ser
plasmo lisada y aislada por
eliminacin mecnica o enzimtica
de la pared celular. El protoplasto es
por lo tanto una clula desnuda,
rodeada por su membrana
plasmtica, potencialmente capaz de
regenerar la pared celular, crecer y
dividirse.

PARA QU SIRVEN?

Los protoplastos son una herramienta

fundamental para la investigacin en biologa
fundamental y aplicada. La ausencia de una
pared celular rgida (obstculo fsico-qumico) y la
completa exposicin de la membrana celular
convierte a los protoplastos en un sistema ideal
para la investigacin en procesos de transporte y
divisin celular, morfognesis, muta gnesis,
seleccin, etc. Quiz la aplicacin ms utilizada
actualmente es la transformacin gentica por
hibridacin o fusin somtica, por introduccinabsorcin de protenas, ADN (vegetal, vrico o
bacteriano), macromolculas, etc. En fitopatologa
se utiliza para estudiar la etiologa de los virus, su
absorcin, procesos infectivos y replicacin; la
especificidad y modo de actuacin de hongos y
bacterias patgenas, la evaluacin de toxinas, y
finalmente la obtencin-seleccin de clones

DE DNDE SE OBTIENEN?
De muy diversas partes de la planta,
cultivadas tantoin vitrocomoex vitro.
As pueden obtenerse protoplastos de
tejidos de callo, pices de raz,
cladodios, pices de tallo, frutos,
ndulos de races, colepteros, lminas
de aleurona de cereales, microsporas e
incluso de tubos polnicos, pero en la
actualidad la fuente de protoplastos
ms habitual es el tejido de mes filo de
las hojas jvenes.

FUSIN DE PROTOPLASTOS
Lafusin de protoplastoses una tcnica
debiotecnologaen la cual se produce la fusin de
lasmembranasde dos o msclulasdando lugar a
unhbrido somtico. La tcnica es ampliamente empleada
para introducir variabilidad en lascepasde inters
biotecnolgico. Tpicamente se realiza mediante
protoplastos vegetales, esto es, clulas vegetales
desprovistas depared celular, si bien tambin puede
efectuarse empleando otrostaxones, como
algunoshongos.
En biotecnologa vegetal, la fusin de protoplastos se
emplea enprogramas de mejora; un ejemplo es la
generacin depoliploides, generalmente ms productivos.
Para ello la metodologa consiste en aplicar pulsos
elctricos a clulas en suspensin (electroformacin) o
inducir la desorganizacin de las membranas
empleandopoli etilenglicol. Esta tcnica, pese a mezclar el
contenido gentico de dos lneas distintas, no est
consideradaingeniera gentica, pues en su ejecucin no
se emplea la tecnologa delADN recombinante.

USO DE PROTOPLASTOS
Se usan los protoplastos en el estudio del comportamiento de lamembrana
plasmtica, incluyendo el ingreso demacromolculasyvirus.
Tambin se usan implante en la transformacin gentica de bacterias y de clulas
vegetales. Al estar desprovistos de pared, es ms fcil introducirADNexgeno en los
protoplastos, que en las bacterias o clulas vegetales ntegras. De ah que los
protoplastos son ampliamente usados en Ingeniera Gentica de Bacterias y en el
estudio de la expresin temporal de genes en plantas. Por otro lado, a partir de un
protoplasto se puederegeneraruna planta completa usandomicro propagacin, una
tcnica moderna usada encultivo de tejidos vegetales.
Finalmente, tambin se usan protoplastos en elmejoramiento gentico vegetal. Para
ello se usa una tcnica conocida como fusin de protoplastos, en la que protoplastos
de diferentes plantas se fuerzan a fusionarse para generar tejidos hbridos. 2De esta
forma se puede generar:
Plantaspoliploides, fusionando dos plantas de la misma especie, lo que lleva a una
duplicacin del nmero de cromosomas que poseen respecto a las plantas originales.
Plantas que posean cromosomas de distintas especies o variedades en una misma
planta, a partir de la fusin de dos plantas diferentes.

AISLAMIENTO DE PROTOPLASTOS
Aunque exite un mtodo mecanico para aislar protoplastos, el mtodo enzimtico
es actualmente la forma mas importante y efectiva para ese propsito.
El mtodo enzimtico para el aislamiento de los protoplastos consiste en incubar las n
clulas en una mezcla de enzimas que degradan la pared celular. Los principales
factores que se deven considerar para el xito de este mtodo son:
a) El tipo de enzimas que se utilizaran
b) La composicin del medio en que ellas actuaran;y
c) El material se origen de los protoplastos.

MTODOS

Purificacin de enzimas

Para optimizar la viabilidad de los protoplastos se deben purificar las enzimas

de las sales e impurezas, de la siguiente manera:
Disolver 5g de preparacin enzimtica en 20 ml de amortiguador fosfato 1
mM (pH 6)
Esperar una hora, centrifugar solucin a 12000 g por 10 minutos, para
remover impurezas insolubles.
Llevar el sobrenadante a una columna de Sephadex G 50 (4 x 20 cm) y
recoja fracciones de elusin 20 x 10 ml. Se deja reposar durante 280
minutos, para posteriormente, realizar pruebas para medir la actividad
enzimtica y concentracin proteica. Reunir las fracciones que contienen
protena y almacenarlas a 4 C.

AISLAMIENTO DE PROTOPLASTOS DEL

MES FIL
Se debe realizar bajo una cmara de flujo laminar de la siguiente manera:
Remover la epidermis inferior desprendindola con pinzas finas. Algunas
veces los protoplastos resultan ms estables si el tejido se deja durante 1 a
2 horas en el regulador osmtico para lograr equilibrio antes del
tratamiento enzimtico.
Transferir secciones de hoja a placa Petri de 15x100 mm, que contenga 10
ml de una solucin de mezcla enzima E3 y de medio A2 para el cultivo de
protoplastos en una proporcin 1:1.
Incubar partes foliares en mezcla de enzimas durante 4 a 12 horas en
oscuridad, a 22-25 C. agitando suavemente cada hora. Observar la
liberacin de protoplastos en un microscopio invertido.

LAVADO DE PROTOPLASTOS
Para el lavado de protoplastos de procede de la siguiente manera:
Con pipeta Pasteur, remover de la placa la suspensin de
protoplastos y pasarla por un tamiz de nylon con un dimetro de
poro (30-100 mm) que permita el paso de los protoplastos y
retenga los restos de tejido y grupos de clulas no digeridas
(Echenique V.et al2004).
Transfiera la solucin tamizada a un tubo de ensayo y centrifugar a
100g durante 3 minutos.
Remueva el sobrenadante y vuelva a suspender los protoplastos en
9 ml de solucin A4. Aadir lentamente 1 ml de solucin A3,
colocndola en capas sobre la suspensin de protoplastos en la
solucin A4. Centrifugue a 100g durante 5 minutos.
Remover los protoplastos de la interface de las soluciones A3/A4
con una pipeta Pasteur, suspndalos de nuevo en 10 ml de medio,
y centrifugue a 100g durante 3 minutos. Con la centrifugacin, los
protoplastos se sedimentan ya que el potencial osmtico es
regulado con manitol y diferentes sales.
La flotacin, en el procedimiento de lavado da como resultado una
poblacin pura de protoplasto de mes filos viables e intactos.
Remover el sobrenadante, vuelva a suspender los protoplastos en
el medio de Cultivo, y cultive segn se describe ms adelante.

Soluciones (de 100 ml) para el lavado de

protoplastos
Compuest Cantidades (mg) segn tipo de
o
solucin

A3

A4

A5

CaCl2
(mg)

50

50

50

KH2PO4

10

10

10

Sacarosa
(mg)

13,68

Manitol
(mg)

7280

7280

Percoll
(%)

30

pH

5,6

5,6

5,6

CULTIVO DE PROTOPLASTOS
Para el cultivo de
protoplastos, al igual que
para su aislamiento, todas
las operaciones se deben
hacer aspticamente, sea
que se trabaje con medios
lquidos o medios slidos.

PROPIEDADES Y APLICACIONES INTERESANTES:

Pueden multiplicarse y desarrollarestructurassimilares a embriones y desde
ellos,plantasadultas.
Permite chequear clulas en vez de plantas enteras para seleccionar una caracterstica
ventajosa (ej.Resistenciaotoleranciaa un herbicida).
Las clulas vegetales se pueden hacer crecer en un medio liquido en ellaboratorioo en
grandes biorreactores, comofuentesdeproductossecundarios tales como medicamentos u
otros productos industriales.
Pueden fusionarse con protoplastos de otros tipos o especies, obteniendo hbridos somticos
incluso de especies sexualmente incompatibles. Lafusinde protoplastos tambin perite el
intercambio de orgnulos citoplasmticos y la recombinacin gnica entre genomas
mitocondriales o cloroplsticas diferentes.
Pueden incorporar nuevos genes mediantevectoresadecuados (virus, plsmidos, micro
inyecciones,fusionesde protoplastos). Podemos chequear el resultado del constructo gnico
en el protoplasto o regenerar la planta. Estos transgenes permiten a las plantas modificar y
mejorar sus caractersticas ( Ej. Mayor resistencia a plagas, rango de salinidad mas amplio,
mejores caractersticas organolpticas,..).
Permiten obtener lneas celulares di haploides a partir de cultivos haploides. Se hace con un
tratamiento con colchicina que origina la no separacin de los ncleos hijos tras la duplicacin
del nmero decromosomas. Los di haploides generan lneas homocigotas rpidamente,
interesantes enprogramasde multiplicacin.

PROCESOS DE INDUCCIN TENEMOS DOS

TIPOS:
Qumicos: en ellos se usan
sustancias aglutinantes como el poli
etilenglicol (PEG) o el dimetil sulfxido
(DMSO) y,
Fsicos: como la electro fusin, que
consiste en la induccin de una
bipolarizacin de los protoplastos
mediante corrientes alternas de alta
frecuencia, que van a hacer contactar y
alinearse a los protoplastos siguiendo las
lneas del campo elctrico generado, y en
ese momento con un pulso de corriente
continua se consigue la fusin de las
clulas.