Determinacin de clulas

somticas en leche por

cuenta microscpica directa

OBJETIVO:
Instruir sobre el mtodo de
determinacin de clulas somticas
al personal de laboratorio de control
de calidad

Clulas somticas
El contenido expresa el grado de irritacin
mamaria de los cuartos afectados, lo cual
ocasiona prdida en la produccin y
modificaciones
en
la
composicin
fisicoqumica de la leche procedente de esos
cuartos.

Clulas somticas
Es la expresin del estado de salud mamaria
y del valor higinico de la leche, por lo que
su contenido es un criterio que se debera
incluir en la clasificacin y pago de leche al
productor.

Mastitis
Diagnstico:
Examen fsico
Mtodos qumicos: pH, cloruros, catalasa,
prueba de California, etc.
Mtodos confirmativos: Coulter, recuento de
clulas somticas, etc.
Examen bacteriolgico

Sangre
Es un tejido conectivo fluido de color rojo
caracterstico por la presencia del pigmento
hemoglobinico contenido en los eritrocitos.
Constituida por:
*una fase slida, integrada por los elementos formes
(clulas) que comprende los glbulos blancos, glbulos
rojos y las plaquetas.
*una fase liquida representada por el plasma
sanguneo.
Su funcin principal es de trasporte (Ej. O2, CO2,
glucosa, aminocidos, lpidos, sales, hormonas, etc.)

Hematopoyesis
El proceso a travs del cual se generan las
clulas de la sangre y ocurre bajo condiciones
muy especificas en el interior de los huesos,
en la llamada mdula

Definicin de leucocitos
Los leucocitos son un conjunto heterogneo de clulas
sanguneas llamadas glbulos blancos que son los
efectores celulares de la respuesta inmune
Se originan en la mdula sea y en el tejido linftico
Son clulas con ncleo, mitocondrias y otros orgnulos
celulares.
Hay diferentes grupos de glbulos blancos: los llamados
polimorfonucleares (neutrfilos, eosinfilos y los
basfilos) y los mononucleares (los linfocitos y los
monocitos).

Morfologa normal de los glbulos

blancos (leucocitos) en sangre.

Neutrfilo

Eosinfilo

Monocito

Linfocito

Basfilo

Determinacin de clulas somticas

(en leche)
por cuenta directa al microscopio

Norma NMX-F-700-COFOCALEC-2004

Determinacin de clulas somticas

por cuenta directa en microscopio

UTILIZANDO EL METODO BASADO EN LA

NORMA NMX-F-700-COFOCALEC-2004

Objetivo del curso

Implementar el mtodo de determinacin de clulas
somticas por cuenta directa al microscopio, basado en
la Norma NMX-F-700-COFOCALEC-2004. En el
laboratorio de control de calidad en Gerencia Estatal
Tlaxcala

Alcance del curso

Instruir a todo el personal que labora en el laboratorio
de control de calidad en Liconsa Gerencia Estatal
Tlaxcala, sobre el mtodo de determinacin de clulas
somticas.

Mtodo
Objetivo: Describir el procedimiento para la

determinacin de clulas somticas por cuenta

directa al microscopio.
Alcance: Este procedimiento es aplicable a
leche cruda.

La leche
Es la secrecin natural de las glndulas mamarias, sin
calostro y sin substraccin alguna de sus componentes,
que no ha sido sometida a tratamientos trmicos.
La Ley Federal de Salud (1994), en su artculo 240
establece que la leche para el consumo humano se
entiende a la secrecin natural de la glndula mamaria
de vacas sanas y bien alimentadas y cuando proceda
de otra especie animal se designar con el nombre de
sta.

Clulas somticas
Las clulas somticas estn constituidas por una asociacin de
leucocitos y clulas epiteliales. Los leucocitos se introducen en la
leche en respuesta a la inflamacin que puede aparecer debido a
una enfermedad o, a veces, a una lesin. Las clulas epiteliales se
desprenden del revestimiento del tejido de la ubre (Blowey y
Edmondson, 1995).
El conteo de clulas somticas (CCS) es el nmero de clulas por
mililitro de leche, es por consiguiente un indicador til para la
concentracin de leucocitos en leche. El CCS, es usado como un
indicador de la salud de la glndula mamaria (Bradley y Green,
2005).

Glndula Mamaria
Las glndulas mamarias son glndulas drmicas modificadas, que
se clasifican como glndulas exocrinas cuya funcin es secretar
leche para la alimentacin de los animales jvenes, durante
periodos diversos de vida post-natal; crecen durante la preez y
comienza a secretar leche despus del parto (Bez, 2002; Bath,
1982).
En la glndula mamaria, la ubre bovina est constituida por cuatro
glndulas mamarias, mejor conocidas como cuartos. Cada cuarto
es una unidad funcional en si misma que opera
independientemente y drena la leche por medio de su propio canal.

Estructura de la glndula mamaria

Microscopio

Cuenta directa al microscopio

Observacin directa al microscopio de frotis
teidos de una cantidad conocida de leche
y mediante un calculo sencillo a partir del
nmero de microorganismos y/o clulas
contadas y del valor del rea del
microscopio, se obtiene una cifra
aproximada del contenido real en la leche.

Cuenta directa al microscopio

Aplicacin:
Se ha utilizado especialmente en leche
cruda y como todos los mtodos
microbiolgicos,
permite
obtener
informacin sobre las condiciones sanitarias
del producto.

Cuenta directa al microscopio

Clulas somticas: todas aquellas clulas
con ncleo (leucocitos y clulas epiteliales)
La presencia de abundantes clulas
constituye una fuerte evidencia de un
proceso infeccioso en la ubre del animal

Cuenta directa al microscopio

Ventajas:
Rpido
Econmico
Los frotis pueden almacenarse y volverse a leer
sin que existan cambios aparentes en la
morfologa y el color de las clulas

Desventajas:
Existen muchos factores que afectan la precisin
de la tcnica

Cuenta directa al microscopio

Factores responsables de la variacin
Inexactitud de medir 0,01 mL (10ML)
Errores en la preparacin y tincin de los frotis
La tincin no uniforme de las clulas
La mnima cantidad de leche examinada
La distribucin no uniforme de las clulas en el
frotis
El nmero de campos contados

Cuenta directa al microscopio

Factores responsables de la variacin
Variaciones del microscopio (iluminacin,
nitidez, uso de filtros)
Secado de los frotis en superficies desniveladas
Destreza y experiencia del analista
Errores en la lectura y en los clculos

Metodologa segn NMX-F-700-COFOCALEC-2004

Materiales y equipo
Vaso de precipitado de 250mL
Pipetas bacteriolgicas de 10mL con divisin 0.1mL, con tapn de
algodn.
Filtros resistentes a solventes, con un tamao de poro de 10 a 12
milimicras o inferior.
Micropipeta con capacidad de 0.01mL y tolerancia mxima de 2
% , verificada y/o calibrada.
Portaobjetos limpios y desengrasados
Placa gua con el permetro marcada de un rectngulo, de 20mm
por 5mm, para ser colocada bajo los portaobjetos.

 Bao de agua con termostato de 30 -70 C.

Microscopio ptico con objetivos de 500X -1000X.
Parrilla de calentamiento, capaz de mantener la
temperatura de 30-50 C .
Asa de metal con punta de "L ".

Metodologa segn NMX-F-700-COFOCALEC-2004

Calentar la leche cruda en un bao de agua entre 30 y

40C, mezclarla y enfriarla a temperatura ambiente
Preparar dos frotis por muestra de la siguiente manera:
a)

Limpiar el porta objetos con etanol, secarlo con papel

b)

Tomar con una micropipeta 0,01 mL de leche cruda

preparada para su anlisis, limpiar cuidadosamente el
exterior de la punta en contacto con la leche

c)

Colocar los portaobjetos en la placa gua con reas de 20mm

y 5 mm, descargar la alcuota sobre el portaobjetos, llenar y
distribuir homogneamente la muestra en el rea descrita

Metodologa segn NMX-F-700-COFOCALEC-2004

a) Secar el frotis sobre una placa caliente o a temperatura
ambiente por varias horas

Sumergir el portaobjetos completamente seco en la

solucin colorante durante 60 min.
Sacar y escurrir el porta objetos, secar a temperatura
ambiente durante 30min.
Lavar el porta objetos por inmersin con agua con
agua corriente hasta la completa eliminacin del
exceso de colorante, escurrir y secar nuevamente
Guardar el portaobjetos en un lugar libre de polvo

Metodologa segn NMX-F-700-COFOCALEC-2004

Solucin colorante
Reactivos por cada 100 mL
a)
b)
c)
d)

Etanol al 95%
Tetracloroetano
Azul demetileno
cido actico glacial

54 mL
40 mL
0,6 g
6 mL

Metodologa segn NMX-F-700-COFOCALEC-2004

Preparacin
Mezclar el etanol y el tetracloroetano en un vaso de
precipitado y calentar en un bao de agua a 60-70C,
agregar el azul de metileno, mezclar cuidadosamente,
enfriar la mezclar cuidadosamente, enfriarla mezcla a 4C
y posteriormente agregar el cido actico glacial
Filtrar la solucin y almacenarla en un frasco con tapa
hermtica, si es necesario filtrar la solucin una vez ms
antes de su uso

Metodologa segn NMX-F-700-COFOCALEC-2004

Recuento
La lectura se realiza en un microscopio de 500x a 1000x
(inmersin)
Contar todas las clulas nucleadas (por lo menos 400)
Realizar el recuento en franjas verticales de preferencia en
el tercio central de la preparacin, evitando el recuento
intencionado en la periferia del frotis
si

no

5 mm
20 mm

Metodologa segn NMX-F-700-COFOCALEC-2004

El largo de cada franja que debe ser contada es de

5 mm, el ancho corresponde al diametro del
campo del microscopio
5 mm

Para una muestra de 0.01 mL el factor de trabajo

(wf) se obtiene de la siguiente frmula:

Metodologa segn NMX-F-700-COFOCALEC-2004

wf= 20x100
dxb
Donde:
20 = largo en mm del frotis en estudio
100 = factor de conversin (1mL de muestra)
d = dimetro en mm del campo del microscopio
b = nmero de franjas contadas completamente

Metodologa segn NMX-F-700-COFOCALEC-2004

El nmero de clulas contadas es

multiplicado por el factor de trabajo (wf)
para obtener el nmero de clulas por mL
de muestra
Clulas / mL = wf x Numero de clulas
contadas

Metodologa segn NMX-F-700-COFOCALEC-2004

Conteo de clulas somticas (CCS) / mL

Parmetro

Especificaciones

Clase 1

< 400 000

Clase 2

401 000 a 500 000

Clase 3

501 000 a 749 000

Clase 4

750 000 a 1000 000

MTODOS ALTERNATIVOS
A) FossomaticR (CE)
B) Contador Infrarrojo (CI) tambin conocido
como Delaval Cell Counter (DCCR).
C) Prueba de California para Mastitis (CMT)
D)Prueba de Wisconsin (WMT)

MTODOS DE CONTEO ELECTRNICO

CELULAR
Los mtodos electrnicos tienen en la
actualidad una aplicacin universal, sobre todo
en laboratorios de control lechero o dedicados
al diagnstico o investigacin de la mastitis,
utilizndose aparatos de recuentos celulares
como el Fossomatic y Delaval Cell Counter

FOSSOMATIC
Consiste en el filtrado de una solucin de leche
mezclada con detergente (Triton X-100 EDTA)
a travs de una membrana con poros finos. Un
procedimiento colorimtrico basado en la
reaccin con el ADN de las clulas es entonces
utilizado para determinar el contenido de ADN
que esta relacionado directamente con el
nmero de clulas presentes en la muestra
inicial

DELAVAL CELL COUNTER.

Es un equipo porttil, que funciona con batera
y posee un medidor ptico de clulas
somticas de la leche. Esto permite estudiar el
estado de salud de la ubre de la vaca, tambin
posibilita el estudio de los estndares
higinicos en la leche del tanque.

PRUEBA DE CALIFORNIA PARA

MASTITIS(CMT)
Esta prueba ha sido empleada durante
dcadas y sigue siendo la prueba ms utilizada
a nivel de campo para el diagnstico de
mastitis en el ganado bovino lechero
Es una prueba sencilla que es til para detectar
la mastitis subclnica por valorar groseramente
el recuento de clulas de la leche. No
proporciona un resultado numrico, sino ms
bien una indicacin de si el recuento es
elevado o bajo

PRUEBA DE WISCONSIN PARA MASTITIS

(WMT).
Esta prueba fue diseada para el uso en el
laboratorio, y es utilizada para estimar el
contenido de clulas somticas de muestras de
leche fresca mezclada o leche de tanques de
enfriamiento, as como para muestreo de vacas
individuales.

F I N