SECUNCIAMIENTO Y

CLONACIN DEL ADN

DOCENTE: Q.F. ANGLICA MINAYA

GALARRETA
INTEGRANTES:
CALIXTO CHAHUA, JANET
CHONTAY SALAS, DIANA
DIAZ GRANDE, HECTOR
HUANCA HUAMAN, FREDY
NORIEGA SANJINEZ, BIELKA
QUINTO ANCIETA, ROCO
SANCHEZ QUIONES, MARA

SECUENCIAMIENTO
DEL ADN

DEFINICIN
Es una tcnica en la que
se hace un anlisis ms
detallado de la estructura
del ADN y consiste en un
conjunto de tcnicas y
mtodos bioqumicos que
nos permiten averiguar la
secuencia
de
los
nucletidos (A, C, G, T)
en el ADN.

Qu es una secuencia de ADN?

Es una disposicin u ordenamiento de las
cuatro bases (A, T, C, G), en la molcula de
ADN.

Qu es la secuenciacin ?
Es un conjunto de mtodo y tcnicas
bioqumicas que nos permite descubrir
como es la secuencia del ADN.

MTODOS DE
SECUENCIACIN DE ADN

Histricamente hay dos

mtodos de secuenciacin del
ADN

Mtodo de
Maxam & Gilbert
o mtodo de
degradacin
qumica.

Secuenciacin por
terminador
fluorescente
Mtodo de Sanger. Hoy en
da es el ms usado en los
laboratorios
Secuenciacin aleloespecfica por
bisulfito

MTODOS DE
SECUENCIAMIENTO DEL ADN
Histricamente hay dos
mtodos de secuenciacin
del ADN:
1. Mtodo de Maxam & Gilbert o
mtodo de degradacin qumica.
2. Mtodo de Sanger, que usa
dideoxynucleotidos.
Hoy en da el Mtodo Sanger es el ms
usado en los laboratorios

MTODO QUMICO VS MTODO

ENZIMTICO
Mtodo qumico de
Maxam y Gilbert
Se utiliza reactivos Para
romper zonas especificas de
las cadenas.
Allamente txicos y grandes
cantidades de ADN marcada
radiactividad.
Degradacin de DNA
Mayor complejidad tcnica
Utiliza DNA directamente
Los reactivos que se usan en
el mtodo no se pueden
adaptar para utilizarse en un
kit biolgico estndar

Mtodo enzimtico
de Sanger
DNA polimerasas contiene
pocos reactivos txicos y
cantidades menores de
radioactividad.
Se conserva DNA
Mas fcil de utilizar
Cada comienzo de lectura
requiere la clonacin de un
DNA
Se pueden realizar en unas
horas
Las reacciones son mas puras
con menos contaminantes que
pueden efectuar la resolucin
en gel.

SECUENCIAMIENTO
DEL ADN

Constituye la informacin gentica heredable del ncleo celular, los

plsmidos, la mitocondria y cloroplastos (En plantas) que forman la base de
los programas de desarrollo de los seres vivos.
Determinar la secuencia de ADN es til en el estudio de la investigacin
bsica de los procesos biolgicos, as como en campos aplicados, como la
investigacin forense.
El desarrollo de la secuenciacin del ADN ha acelerado la investigacin y
los descubrimientos en biologa.
Las tcnicas actuales permiten realizar secuenciacin a gran velocidad, de
gran importancia para proyectos de secuenciacin a gran escala como el
Proyecto Genoma Humano

MTODO DE MAXAM &

GILBERT
El
protocolo
de
secuenciacin
de
Maxam-Gilbert
utiliza
reacciones
qumicas
en
la
escisin en las bases
especficas
para
generar, a partir de
copias pre-marcadas
de la cadena de
ADN
para
ser
secuenciados.

MTODO DE MAXAM &

GILBERT
Esta basada en la modificacin qumica del
DNA y posterior escisin de bases
especficas.
El mtodo requiere marcaje radiactivo en uno
de los extremos y la purificacin del
fragmento de ADN que se desea secuenciar.
El tratamiento qumico genera rupturas de
uno o dos de los cuatro nucletidos en cada
una de las cuatro reacciones (G, A+G, C,
C+T).
Los fragmentos posteriormente se separan
por tamao medianteelectroforesis en gel o
autoradiografa.

MTODO DE MAXAM &

GILBERT
Las reacciones qumicas que se
fragmentar el ADN son las siguientes:

Corte de las
purinas.
La A y G se
metilan con
dimetil sulfato
(DMS), la reaccin
es tratada en
condiciones
alcalinas.

Corte de
adeninas.
Esta reaccin es
una variacin de la
anterior. Las
purinas metiladas
se tratan con un
cido diluido, Esto
favorece el corte
de las adeninas
metiladas.

Corte de
pirimidinas.
Esta reaccin
utiliza el
reactivo
hidracina, que
corta las bases
C y T.

utilizan

para

Corte de
citosina. La
presencia de NaCl
2M inhibe la
reaccin de
hidracina con T, y
el tratamiento
posterior con
piperidina,
produce
solamente
fragmentos que
terminan en C.

MTODO DE SANGER
En diciembre de 1977 se
publica el trabajo de Sanger,
Nicklen y Coulson que
propone un nuevo mtodo
para
determinar
las
secuencias de bases en una
molcula de ADN; el mtodo
de secuenciacin enzimtico
sali casi al mismo tiempo
que el de Maxam Gilbert,
pero
ha
sido
el
ms
utilizado. Esto se debe en
gran parte a que se han
realizado grandes avances
en la automatizacin de esta
tcnica.

Para obtener la secuencia de bases nitrogenadas de un segmento

de ADN por el mtodo enzimtico de terminacin de cadena, se
necesitan los siguientes compuestos

El ADN molde o segmento de

ADN que se desea secuenciar.
Un enzima que replique el ADN
Un cebador o "primer
Los cuatro nucletidos trifosfato
(dATP, dCTP, dGTP y dTTP).
Nucletidos didesoxi (ddATP,
ddTTP, ddCTP y ddGTP)

SNTESIS A CARGO DE
UN AND POLIMERASA
1.-Sntesis a cargo de un ADN
polimerasa

segment
o

2.- Uso de nucletidos

terminadores

3.- Anlisis de resultados (electroforesis)

Como la
polimerizaci
n es solo en
direccin 5 a
3, los
fragmentos
ms cortos
estarn en 5
y los ms
largos que se
encontrarn
en la
direccin 3

Esto se logra por una

electroforesis ya sea en geles
de
poliacrilamida
o
en
capilares
con
polmeros
lquidos

Detecten diferencias
en longitud de una
base

SEPARACIN DE LOS
FRAGMENTOS
(SANGER)
Todos
los
mtodos
actuales
de
secuenciacin
requieren
que
la
separacin
de
los
fragmentos de DNA
detecten diferencias en
longitud de una base

Una vez terminada la electroforesis,

el gel se pone en contacto con una
pelcula fotogrfica de
autorradiografa.

MTODO QUMICO VS
MTODO ENZIMTICO

CLONACIN

ENZIMAS DE
RESTRICCIN

ENZIMAS DE RESTRICCIN
En 1975 Daniel Nathans y Hamilton
O. Smith descubrieron un tipo de
protenas las enzimas
endonucleasas o enzimas de
restriccin que actan como
tijeras moleculares, cortando la
doble cadena de ADN a travs del
esqueleto de fosfatos sin daar las
bases. El descubrimiento de estas
enzimas condujo a dichos
microbilogos al Nobel en 1978 y
dio origen a la ingeniera gentica

DANIEL
NATHANS

HAMILTON O.
SMITH

ENZIMAS ENDONUCLEASA
Las enzimas actan cortando
la doble cadena de ADN a
travez del esqueleto de
fosfatos sin daar las bases.
Son extraidas de bacterias las
cuales que utilizan como
mecanismo de defensa.

El corte realizado por

una
enzima
de
restriccin puede ser
de dos tipos.
Extremos
cohesivos.
Extremos
romos.

TIPOS DE ENZIMAS DE
RESTRICCIN
TIPO I: RESTRICCION Y
MODIFICACION

Una sola enzima (con 3 subunidades) tiene actividad de restriccin (corta) y modificacin
(metila). Al reconocer la secuencia especfica de DNA corta al azar en sitios distintos al sitio
de reconocimiento, ya sea corriente arriba o corriente abajo.

TIPO II:
RESTRICCION

Solo tienen actividad de restriccin. Otras enzimas llevan a cabo la metilacin. El corte es
efectuado en el sitio de reconocimiento, o bien, cerca de l, por lo que el corte es resistente
y predecible.

TIPO III: RESTRICCION Y

MODIFICACION

Se utiliza una enzima oligomrica que realiza todas las actividades enzimticas. Tienen
funcin de restriccin y modificacin. Cortan de 25 a 27 pares de bases lejos del sitio de
reconocimiento, dejando extremos cohesivos

CLONACI
N
MOLECULA
R
CLONACI
N EN
ESPECIES
DE
EXTINCIN

CLONACI
N HUMANA

CLONACI
N
CELULAR

TIPOS DE
CLONACI
N

CLONACIN
DE
ORGANISMO
S EN FORMA
NATURAL

CLONACIN EN
LA
INVESTIGACI
N DE CLULAS
MADRES

CLONACIN
TERAPEUTIC
A

CLONACIN
MOLECULAR

Se basa especficamente
Se basa especficamente
en extraer una parte del
en extraer una parte del
ADN y luego insertarlo
ADN y luego insertarlo
en donde sea
en donde sea
conveniente
conveniente
(precisamente un
(precisamente un
plsmido o algo en
plsmido o algo en
donde sea posible la
donde sea posible la
clonacin).
Expresi
clonacin).n de
genes
Vacunas
recombi
nantes.

Tecnolo
ga anti
sentido

Aplicacio
nes

Producci
n de
frmacos

Producci
n de
protenas
humanas

Fragme
ntacin
y
Ligaci
n

Transfeccin
(clula)
Transformacin
(bacterias)

Seleccin

Anlisis
mutacion
al

Teraputi
ca

Paso
s:

Frag
ment
acin

Ligacin

Transfec
cin

Selecci
n

CLONACIN
CELULAR

Consiste en la generacin de una

poblacin de clulas a partir de una
nica clula. Este tipo de clonacin
es bastante sencilla cuando se
trata de organismos procariontes
unicelulares, pues se reproducen
naturalmente de ese modo, por lo
que solo se requiere aislar una
clula y colocarla en un medio de
cultivo
con
las
sustancias
adecuadas. Tambin se pueden
cultivar clulas de organismos
pluricelulares,
induciendo
su
proliferacin; al dividirse por
mitosis, cada clula hija es idntica
a su progenitora.

CLONACIN
TERAPUTICA

UTILIDAD
Quemaduras
Transplante de organos
Mal de Alzheimer, o

Mal

de

CLONACIN DE
ORGANISMOS EN
FORMA NATURAL

Consiste en crear un
nuevo organismo con la
misma informacin
gentica proveniente de
una clula existente.
es un mtodo asexual,
donde la fertilizacin
no ocurre.
En trminos generales

CLONACIN EN
ESPECIES EN PELIGRO
DE EXTINCIN
Consiste en
la
congelacin de
clulas de animales extintos o en
peligros de extincin para poder
obtener, mas tarde, la secuencia de
ADN, con la finalidad de clonar la
especie.
Es todo un reto, pero se han
obtenido algunos indicios de que
sea posible, como el 2001 clonaron
un gaur, que esta en peligro de
extincin, pero muri a los dos das.

VECTORES DE ADN

Los vectores de clonacin son

molculas que llevan
insertados fragmentos de
material gentico que nosotros
queremos introducir en el
hospedador , molculas
transportadoras que
transfieren y replican
fragmentos de ADN

TIPOS DE VECTORES
PLSMIDOS

BACTERIFAG
OS

CSMIDOS

CROMOSOMAS
ARTIFICIALES

PLSMIDOS

Los plsmidos son molculas

de DNA de doble cadena extra
cromosmicas de origen
natural que tienen un origen
de replicacin (ori) y que se
replican autnomamente en
las clula bacterianas.

BACTERIFAGOS
Son virus que infectan
especficamente a bacterias. Son
estructuras simples que consisten
en molculas de ADN que
transportan algunos genes,
incluyendo muchos que participan en
la replicacin rodeadas por una
cubierta protectiva o capside.

CSMIDOS
Son plsmidos a los que se
les ha insertado la
regin cos del fago
lambda. Son
particularmente tiles para
clonar insertos de gran
tamao, debido a que son
muy pequeos
(8 kb o menos).

CSMIDOS
Son plsmidos a los que
se les ha insertado la
regin cos del fago
lambda.
Son
particularmente
tiles
para
clonar insertos de gran
tamao, debido a que
son muy pequeos
(8 kb o menos).

CROMOSOMAS

ARTIFICIALES
BAC

YAC

Cromosoma artificial de leva

dura

Los
YAC
son
cromosomas
artificiales de levadura. Un YAC
tiene telmeros en sus extremos,
un origen de replicacin y un
centrmero. Estos componentes
estn
unidos
a
genes
marcadores de seleccin y a un
grupo de enzimas de restriccin
para insertar ADN exgeno.
Estos cromosomas artificiales de
levadura
permiten
clonar
grandes trozos de ADN, de 100 a
1000 kb.

Cromosoma artificial bacteriano

Un BAC es un cromosoma
artificial bacteriano, basado en el
plsmido de fertilidad (factor F)
de bacterias. Es el ms utilizado.
El factor F es un plsmido que se
replica independientemente y
que
transfiere
informacin
gentica durante la conjugacin
bacteriana.
Los BAC son circulares y muy
estables, con lo que no se
rompen. Tienen un tamao de
100 kb y pueden transportar
insertos de entre 100 y 300 kb.
Solo permiten una copia del
cromosoma por clula.