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SECUENCIAMIENTO
DEL ADN
DEFINICIN
Es una tcnica en la que
se hace un anlisis ms
detallado de la estructura
del ADN y consiste en un
conjunto de tcnicas y
mtodos bioqumicos que
nos permiten averiguar la
secuencia
de
los
nucletidos (A, C, G, T)
en el ADN.
Qu es la secuenciacin ?
Es un conjunto de mtodo y tcnicas
bioqumicas que nos permite descubrir
como es la secuencia del ADN.
MTODOS DE
SECUENCIACIN DE ADN
Mtodo de
Maxam & Gilbert
o mtodo de
degradacin
qumica.
Secuenciacin por
terminador
fluorescente
Mtodo de Sanger. Hoy en
da es el ms usado en los
laboratorios
Secuenciacin aleloespecfica por
bisulfito
MTODOS DE
SECUENCIAMIENTO DEL ADN
Histricamente hay dos
mtodos de secuenciacin
del ADN:
1. Mtodo de Maxam & Gilbert o
mtodo de degradacin qumica.
2. Mtodo de Sanger, que usa
dideoxynucleotidos.
Hoy en da el Mtodo Sanger es el ms
usado en los laboratorios
Mtodo enzimtico
de Sanger
DNA polimerasas contiene
pocos reactivos txicos y
cantidades menores de
radioactividad.
Se conserva DNA
Mas fcil de utilizar
Cada comienzo de lectura
requiere la clonacin de un
DNA
Se pueden realizar en unas
horas
Las reacciones son mas puras
con menos contaminantes que
pueden efectuar la resolucin
en gel.
SECUENCIAMIENTO
DEL ADN
Corte de las
purinas.
La A y G se
metilan con
dimetil sulfato
(DMS), la reaccin
es tratada en
condiciones
alcalinas.
Corte de
adeninas.
Esta reaccin es
una variacin de la
anterior. Las
purinas metiladas
se tratan con un
cido diluido, Esto
favorece el corte
de las adeninas
metiladas.
Corte de
pirimidinas.
Esta reaccin
utiliza el
reactivo
hidracina, que
corta las bases
C y T.
utilizan
para
Corte de
citosina. La
presencia de NaCl
2M inhibe la
reaccin de
hidracina con T, y
el tratamiento
posterior con
piperidina,
produce
solamente
fragmentos que
terminan en C.
MTODO DE SANGER
En diciembre de 1977 se
publica el trabajo de Sanger,
Nicklen y Coulson que
propone un nuevo mtodo
para
determinar
las
secuencias de bases en una
molcula de ADN; el mtodo
de secuenciacin enzimtico
sali casi al mismo tiempo
que el de Maxam Gilbert,
pero
ha
sido
el
ms
utilizado. Esto se debe en
gran parte a que se han
realizado grandes avances
en la automatizacin de esta
tcnica.
SNTESIS A CARGO DE
UN AND POLIMERASA
1.-Sntesis a cargo de un ADN
polimerasa
segment
o
Como la
polimerizaci
n es solo en
direccin 5 a
3, los
fragmentos
ms cortos
estarn en 5
y los ms
largos que se
encontrarn
en la
direccin 3
Detecten diferencias
en longitud de una
base
SEPARACIN DE LOS
FRAGMENTOS
(SANGER)
Todos
los
mtodos
actuales
de
secuenciacin
requieren
que
la
separacin
de
los
fragmentos de DNA
detecten diferencias en
longitud de una base
MTODO QUMICO VS
MTODO ENZIMTICO
CLONACIN
ENZIMAS DE
RESTRICCIN
ENZIMAS DE RESTRICCIN
En 1975 Daniel Nathans y Hamilton
O. Smith descubrieron un tipo de
protenas las enzimas
endonucleasas o enzimas de
restriccin que actan como
tijeras moleculares, cortando la
doble cadena de ADN a travs del
esqueleto de fosfatos sin daar las
bases. El descubrimiento de estas
enzimas condujo a dichos
microbilogos al Nobel en 1978 y
dio origen a la ingeniera gentica
DANIEL
NATHANS
HAMILTON O.
SMITH
ENZIMAS ENDONUCLEASA
Las enzimas actan cortando
la doble cadena de ADN a
travez del esqueleto de
fosfatos sin daar las bases.
Son extraidas de bacterias las
cuales que utilizan como
mecanismo de defensa.
TIPOS DE ENZIMAS DE
RESTRICCIN
TIPO I: RESTRICCION Y
MODIFICACION
Una sola enzima (con 3 subunidades) tiene actividad de restriccin (corta) y modificacin
(metila). Al reconocer la secuencia especfica de DNA corta al azar en sitios distintos al sitio
de reconocimiento, ya sea corriente arriba o corriente abajo.
TIPO II:
RESTRICCION
Solo tienen actividad de restriccin. Otras enzimas llevan a cabo la metilacin. El corte es
efectuado en el sitio de reconocimiento, o bien, cerca de l, por lo que el corte es resistente
y predecible.
Se utiliza una enzima oligomrica que realiza todas las actividades enzimticas. Tienen
funcin de restriccin y modificacin. Cortan de 25 a 27 pares de bases lejos del sitio de
reconocimiento, dejando extremos cohesivos
CLONACI
N
MOLECULA
R
CLONACI
N EN
ESPECIES
DE
EXTINCIN
CLONACI
N HUMANA
CLONACI
N
CELULAR
TIPOS DE
CLONACI
N
CLONACIN
DE
ORGANISMO
S EN FORMA
NATURAL
CLONACIN EN
LA
INVESTIGACI
N DE CLULAS
MADRES
CLONACIN
TERAPEUTIC
A
CLONACIN
MOLECULAR
Se basa especficamente
Se basa especficamente
en extraer una parte del
en extraer una parte del
ADN y luego insertarlo
ADN y luego insertarlo
en donde sea
en donde sea
conveniente
conveniente
(precisamente un
(precisamente un
plsmido o algo en
plsmido o algo en
donde sea posible la
donde sea posible la
clonacin).
Expresi
clonacin).n de
genes
Vacunas
recombi
nantes.
Tecnolo
ga anti
sentido
Aplicacio
nes
Producci
n de
frmacos
Producci
n de
protenas
humanas
Fragme
ntacin
y
Ligaci
n
Transfeccin
(clula)
Transformacin
(bacterias)
Seleccin
Anlisis
mutacion
al
Teraputi
ca
Paso
s:
Frag
ment
acin
Ligacin
Transfec
cin
Selecci
n
CLONACIN
CELULAR
CLONACIN
TERAPUTICA
UTILIDAD
Quemaduras
Transplante de organos
Mal de Alzheimer, o
Mal
de
CLONACIN DE
ORGANISMOS EN
FORMA NATURAL
Consiste en crear un
nuevo organismo con la
misma informacin
gentica proveniente de
una clula existente.
es un mtodo asexual,
donde la fertilizacin
no ocurre.
En trminos generales
CLONACIN EN
ESPECIES EN PELIGRO
DE EXTINCIN
Consiste en
la
congelacin de
clulas de animales extintos o en
peligros de extincin para poder
obtener, mas tarde, la secuencia de
ADN, con la finalidad de clonar la
especie.
Es todo un reto, pero se han
obtenido algunos indicios de que
sea posible, como el 2001 clonaron
un gaur, que esta en peligro de
extincin, pero muri a los dos das.
VECTORES DE ADN
TIPOS DE VECTORES
PLSMIDOS
BACTERIFAG
OS
CSMIDOS
CROMOSOMAS
ARTIFICIALES
PLSMIDOS
BACTERIFAGOS
Son virus que infectan
especficamente a bacterias. Son
estructuras simples que consisten
en molculas de ADN que
transportan algunos genes,
incluyendo muchos que participan en
la replicacin rodeadas por una
cubierta protectiva o capside.
CSMIDOS
Son plsmidos a los que se
les ha insertado la
regin cos del fago
lambda. Son
particularmente tiles para
clonar insertos de gran
tamao, debido a que son
muy pequeos
(8 kb o menos).
CSMIDOS
Son plsmidos a los que
se les ha insertado la
regin cos del fago
lambda.
Son
particularmente
tiles
para
clonar insertos de gran
tamao, debido a que
son muy pequeos
(8 kb o menos).
CROMOSOMAS
ARTIFICIALES
BAC
YAC
Los
YAC
son
cromosomas
artificiales de levadura. Un YAC
tiene telmeros en sus extremos,
un origen de replicacin y un
centrmero. Estos componentes
estn
unidos
a
genes
marcadores de seleccin y a un
grupo de enzimas de restriccin
para insertar ADN exgeno.
Estos cromosomas artificiales de
levadura
permiten
clonar
grandes trozos de ADN, de 100 a
1000 kb.