ANLISIS CUANTITATIVO BASADO EN LA

ALTURA DE LOS PICOS O EN LA

INTEGRACIN DEL REA BAJO LOS PICOS.

PATRN INTERNO

En cromatografa, las reas bajo los picos

proporcionan una medida cuantitativa de la
cantidad de cada componente.
El pico cromatogrfico es la seal del
detector cuando emerge un componente
de la columna.
rea
Seal analtica

Altura, h

Tiempo

tm

tr

 Los

instrumentos cromatogrficos ms
modernos permiten una integracin
precisa del rea de los picos; en caso de
no disponerse de tales equipos, es
necesario llevar a cabo una estimacin
manual del rea.

Los detectores dan una respuesta que es

proporcional a la cantidad de sustancia

El coeficiente de proporcionalidad K es
caracterstico de cada sustancia pero no es
posible predecirlo en forma sencilla

MTODO DEL ESTNDAR INTERNO

Generalmente, en cromatografa cuantitativa el uso de
patrones internos aporta mayor precisin al mtodo ya
que se evitan las incertidumbres asociadas a la inyeccin
de la muestra, estabilidad en el tiempo del sistema
cromatogrfico (flujos, ancho de picos).

MTODO DEL ESTNDAR INTERNO

Este mtodo consiste en introducir en cada

disolucin estndar as como en la muestra una
cantidad exactamente medida de una
sustancia estndar a la que se llama patrn
o estndar interno.

Se selecciona como estndar interno, una

sustancia diferente del analito que presente
propiedades similares a las del analito, tal que
ambos sean afectados similarmente durante el
anlisis.

El

patrn interno, se seleccionar de

forma que tenga propiedades
fsicas y qumicas semejantes a
las del analito.

 La

aplicacin de este mtodo

requiere que el pico del estndar
interno se halle bien separado de los
de los componentes de la muestra y
adems
debe
aparecer
preferiblemente entre los compuestos
bajo anlisis, lo que significa que
presenta
un
comportamiento
cromatogrfico parecido al del los
analitos.

La aplicacin de este mtodo consiste en realizar

medidas simultneas de la respuesta del
instrumento al analito y al estndar interno. El
estndar interno, se aade en una cantidad
conocida y constante a la muestra, y a los
estndares del analito.

EJEMPLO
Una disolucin patrn que contena colesterol 1,29 10-5
M y 5--colestano 5,0 10-6 M, como patrn interno,
origin picos de rea 390 y 486 unidades,
respectivamente, en cromatografa de gases.
0,5 g de leche fueron tratados mediante saponificacin y
extraccin en 2 mL de hexano conteniendo 5--colestano
5,0 10-6 M, y se obtuvo mediante GC bajo idnticas
condiciones experimentales que para la disolucin patrn,
un cromatograma con reas de pico de 245 y 503 unidades
para colesterol y el patrn interno, respectivamente.
Considerando que no exista efecto matriz en la muestra
calcule la concentracin de colesterol en la muestra de
leche.
Peso molecular del colesterol=386,65 g/mol. (Sol. 12,12
g/g).

Analito en el
Patrn

Internal standard

Analito en la
Muestra problema

Para la muestra la relacin entre la seal (Seal M) y

la concentracin (CM) viene dada por:

Dividiendo ambas ecuaciones se tiene:

Donde, f corresponde al factor de respuesta

f=kM/kEI

EJEMPLO
Una disolucin patrn que contena colesterol 1,29 10-5
M y 5--colestano 5,0 10-6 M, como patrn interno,
origin picos de rea 390 y 486 unidades,
respectivamente, en cromatografa de gases.
0,5 g de leche fueron tratados mediante saponificacin y
extraccin en 2 mL de hexano conteniendo 5--colestano
5,0 10-6 M, y se obtuvo mediante GC bajo idnticas
condiciones experimentales que para la disolucin patrn,
un cromatograma con reas de pico de 245 y 503 unidades
para colesterol y el patrn interno, respectivamente.
Considerando que no exista efecto matriz en la muestra
calcule la concentracin de colesterol en la muestra de
leche.
Peso molecular del colesterol=386,65 g/mol. (Sol. 12,12
g/g).

 Una

de las principales razones para usar

los factores de respuesta es para
compensar la irreproducibilidad de
inyecciones manuales en un cromatgrafo
de gases. Los volmenes de inyeccin de
GC pueden ser de 1 microlitro o menos y
son difciles de reproducir. Las diferencias
en el volumen de analito inyectado
conduce a diferencias en las reas de los
picos en el cromatograma

EJERCICIO

La Figura muestra los cromatogramas de cinco

estndares y una muestra. Cada estndar y la muestra
contiene la misma concentracin de un estndar
interno, que es 2,50 mg /mL.
Para los cinco estndares, las concentraciones de analito
son 0,20 mg / ml, 0,40 mg / ml, 0,60 mg / ml, 0,80 mg /
ml, y 1,00 mg / ml, respectivamente. Determinar la
concentracin de analito en la muestra por (a) sin
considerar el patrn interno, es decir con una curva de
calibracin de patrones externa, y
(b) la creacin de una curva de calibracin considerando
el patrn interno.

Para cada enfoque, reportar la concentracin del

analito. Utilice alturas de los picos en lugar de reas de
los picos.

DATOS
Relacin
Concentracin altura de pico altura de pico del Relacin concentracion
de los patrones del patrn
estandar interno alturas
es
0.2
1
5.6
0.179
0.08
0.4
2.5
6.5
0.385
0.16
0.6
4
6.9
0.580
0.24
0.8
6
7.5
0.800
0.32
1
6.5
6.5
1.000
0.4
muestra
3.4
6
0.567
x

En la grfica de calibrado se representa la

relacin Seal analito/Seal de estndar interno
en funcin de la concentracin del analito en los
estndares. De esta manera la respuesta del
instrumento
o
la
seal
analtica
es
independiente, de la fluctuacin debida al mtodo
de anlisis.

1.2
1
0.8

f(x) = 2.57x - 0.03

R = 1

0.6
0.4
0.2
0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0.35

0.4

0.45

K patrn

K EI

FR

2.24

2.232

6.25

2.6

2.404

6.66

2.76

2.415

7.5

2.5

6.5

2.6

2.5

Donde, f corresponde al factor de respuesta

f=kM/kEI este debe ser constante en un
determinado intervalo de concentracin.
Adems,
f tambin viene dado por el
producto de la pendiente de la curva de
calibrado por la concentracin del patrn
interno, cuando se grfica la relacin de las
seales versus la concentracin del estndar.
Mientras que si se grfica la relacin de las
seales
versus
la
relacin
de
las
concentraciones,
la
pendiente
es
directamente el factor de respuesta

Cm/CEI =(0.5666+0.0289)/2.5728
Cm=0,578 mg/L

EJEMPLO
Los datos de la tabla siguiente se obtuvieron
durante la determinacin de antraceno en
salmn, empleando LC en fase reversa y
deteccin fluorimtrica. Se adicion un
compuesto como patrn interno a cada
disolucin estndar y a la muestra. Para la
obtencin del correspondiente cromatograma
se tomaron 2 g de salmn, que fueron
sometidos a digestin suave en microondas y
la disolucin obtenida enrasada a 10 mL.

Determine los ng de antraceno por gramo de

muestra. 1.24 ng/g

EJERCICIO
La
concentracin
de
hidrocarburos
aromticos
polinucleares (PAH) en el suelo se determina mediante la
extraccin de los PAHs con cloruro de metileno. El
extracto se diluye, si es necesario, y los PAHs separados
por HPLC se detectan utilizando un detector UV/ Vis o
de fluorescencia. La calibracin se consigue utilizando
uno o ms estndares externos.
En un anlisis tpico una muestra de 2,013-g de suelo
seco se extrajo con 20,00 ml de cloruro de metileno.
Despus de filtrar para eliminar la tierra, se retira una
porcin de 1,00 ml del extracto y se diluy a 10,00 ml
con acetonitrilo. La inyeccin de 5 l de extracto diluido
en un HPLC da una seal de 0,217 (unidades arbitrarias)
para el fluoranteno PAH. Cuando 5 l de un estndar de
fluoranteno de 20,0 ppm se analizaron utilizando las
mismas condiciones, se mide una seal de 0,258.
Reportar las partes por milln de fluoranteno en el suelo.

S=kC
k=S/C= 0.258 / 20.0 ppm = 0.0129 ppm1
C=S/k= 0.217 / 0.0129 ppm1= 16.8 ppm
(16.8 g/mL (10.00 mL / 1.00 mL) 20.00
mL) / 2.013 g sample = 1670 ppm
fluoranthene

EL MTODO DE NORMALIZACIN DE LAS

REAS O NORMALIZACIN INTERNA

El procedimiento se basa en la
hiptesis de que si todos los
componentes de la mezcla han
eluido del sistema como picos bien
diferenciados y separados, la suma
de
todas
las
reas
puede
normalizarse (por ejemplo hacerse
igual a 100)

 La

normalizacin de rea es un
medio para establecer el porcentaje
de cada componente en la muestra.
Se calcula dividiendo el rea de cada
componente entre el rea total y
multiplicando por 100%, es decir:

 Sin

embargo, esta ecuacin solo

se puede aplicar para una serie
homologa de compuestos de
punto
de
ebullicin
muy
parecidos
y
con
similares
respuestas del detector.

FACTORES DE RESPUESTA
En

general, como la respuesta

del detector es diferente para
las distintas especies de la
mezcla, los valores de las
reas deben corregirse antes
de efectuar la normalizacin.
Esto se hace calculando los
factores de respuesta.

COMO SE CALCULA EL FACTOR

RESPUESTA?

Los factores de respuesta deben calcularse

mediante la introduccin en el sistema de
una
mezcla
patrn
que
contenga
exactamente las mismas especies que se
esperan en las muestras.

Factor de respuesta A= peso A/rea A

Una vez conocido el factor de respuesta de

cada componente en la muestra, se puede
realizar el clculo de normalizacin de rea
con factor de respuesta.

EJEMPLO
El mtodo de la normalizacin de las reas se
aplica para la determinacin de una mezcla
de los alcoholes: n-butilico, iso-butilico, secbutilico, terc-butilico.
Con la finalidad de obtener el factor de
respuesta, se prepar una disolucin patrn
de los alcoholes y se inyect en el
cromatgrafo de gases.
Los resultados del cromatograma obtenido
fueron los siguientes:

CONTINUACIN DEL EJEMPLO

Para una muestra que contiene slo los cuatro

alcoholes se obtuvieron los siguientes datos:
Alcohol

rea de pico

n-butilico

1,731

iso-butilico

3,753

sec-butilico

2,845

terc-butilico

1,117

La concentracin de cafena en bebidas puede ser determinada por una

separacin por HPLC de fase reversa usando una fase mvil de
acetonitrilo al 20% y 80% de agua y una columna C8 no polar.
Los resultados para una serie de inyecciones de 10 L de estndares de
cafena se dan en la siguiente tabla.

[caffeine] (mg/L)
50.0
100.0
125.0
250.0

peak area (arb. units)

226 724
453 762
559 443
1 093 637

Cul es la concentracin de cafena en una muestra si la inyeccin de

10 L da un rea de pico de 424195