Aislamiento, clonado, secuenciación y

expresión de enzimas vegetales en

levaduras

Lic. Cynthia Magallanes Noguera

16 de marzo de 2010
 Previously…
 Obtención y caracterización de cultivos in vitro de RT de diferentes especies
vegetales de interés agronómico y su aplicación en la biorreducción de
alquilarilcetonas.

 Nicotiana tabacum (tabaco)

 Cucumis sativus (pepino)
 Raphanus sativus (rabanito)
 Capsicum annuum var. annuum (pimiento)

OH

RT de RT de O

R. sativus C. sativus
(R)-1b

O Producto
Producto
Producto 1a OH
Prelog
Prelog
Anti-Prelog
Anti-Prelog
R. sativus
H H H H

CONH2 CONH2 (S)-1b

C. sativus
cara si N
N
ADPR cara re ADPR

12.2 12.4 12.6 12.8 13.0 13.2 13.4 13.6 13.8 14.0 14.2 14.4 14.6 14.8 15.0 15.2 15.4 15.6 15.8 16.0 16.2 16.4 16.6 16.8
 Coming soon…

 Con el propósito de disponer de un sistema biocatalítico eficiente y fácil de manejar a

nivel laboratorio, se intentará expresar en levaduras la/s deshidrogenasas piridín
dependientes (ADH) de R. sativus, que han demostrado capacidad de reducir cetonas
proquirales con estereocontrol anti-Prelog.

 Se trabajará con Saccharomyces cerevisiae, ya que ha sido ampliamente usada para

expresar proteínas recombinantes, presentando la ventaja de poder realizar
modificaciones y plegados post-traduccionales del tipo eucariótico, y a la vez un
manejo biotecnológico similar a las células procariotas. Es además un microorganismo
no patógeno, clasificado como GRAS.
 Metodologías de aislamiento, clonado y secuenciación de enzimas
vegetales

Transcripción Traducción

DNA RNA Proteína

Transcripción
inversa

Extracción de DNA
Fragmentación con ER
Construcción de librería de DNA
Screening con sonda marcada
PCR
Secuenciación
Herramientas bioinformáticas
 Transcripción Traducción

DNA RNA Proteína

Transcripción
inversa

Extracción de RNA
Síntesis de cDNA
PCR
Fragmentos clonados en vector
Transformación de E. coli
Screening
Secuenciación
Herramientas bioinformáticas
 Proteína

Purificación de proteína de interés (DEAE-Sepharose, phenyl-

Sepharose, Blue-Sepharose)
Determinación de actividad, PM (gel filtration)
Purificación de la enzima (SDS-PAGE)
Caracterización bioquímica (T, pH)
Determinación de secuencia de aa (Edman, Tripsina)
Herramientas bioinformáticas
Determinación de secuencia del gen (PCR inversa)
Secuenciación

Nie et al. Applied and Environmental Microbiology. (2007). 73: 3759–3764.

Chang C, Meyerowitz E. Proc. Natl. Acad. Sci. (1986) 83: 1408-1412.
Cardillo A, AM Giulietti AM, Marconi P. Electronic Journal of Biotechnology (2006), 9(3):195-198.
 Analysis and sequencing of h6hmRNA, last enzyme in the tropane alkaloids
pathway from anthers and hairy root cultures of Brugmansia candida
(Solanaceae)

Alejandra B. Cardillo, Ana M. Giulietti, Patricia L. Marconi

Departamento Microbiología, Inmunología y Biotecnología. FFyB-
UBA
Hyoscyamine 6-β
hydroxylase

(Anisodamine)

Electronic Journal of Biotechnology 2006, 9(3):195-198

 Anteras de polen y Hairy roots de B. candida

Trizol-Reagent
Aislamiento de RNA total
RNeasy Plant kit

Análisis de integridad de RNA total purificado

Synthesize cDNA

PCR

Primers gen h6h

H. niger 1 Kb

Figure 1. Total RNA isolated by
the RNeasy Plant Kit and
compared to the extraction with
Trizol-Reagent, in B. candida.
Lane 1 RNeasy Plant Kit; lane 2
Trizol-Reagent extraction.
Figure 2. RT-PCR and PCR using specific primers in B.
candida microspore mother cells samples.
Lane 1 Molecular weight marker; lanes 2 and 4, water controls
subjected to both RT and PCR reactions; lanes 3 and 5 PCR
products from microspore mother cells samples.
 Gen de interés

EcoRI

Screening por
restriction mapping

Secuenciación

Herramientas
bioinformaticas

ORF de 1038 pb
344 aa
97% homología con H. niger

Nucleotide and the deduced aminoacid sequence of B. candida H6H cDNA analyzed by the Open Reading Frame
Finder (NCBI).
Expression of Brugmansia candida Hyoscyamine 6beta-Hydroxylase gene in
Saccharomyces cerevisiae and its potential use as biocatalyst

Saccharomyces cerevisiae
• Modificaciones post-traduccionales eucariotas
• Fácil manipulación y rápido crecimiento
• No es patógeno
• Microorganismo GRAS

pYES 2.1/V5 – His - TOPO pAC3-15

Vector de
cDNA h6h
expresión
pYES 2.1 con promotor GAL pH6H2-2
 Transformación
pAC3-15 Tagged H6H protein

pH6H2-2 Untagged H6H protein

Ensayos de expresión

Western blot performed with cell lysates of S. cerevisiae

producing the recombinant H6H enzyme from B. candida after
different post-induction times: 0, 4, 8, 12, 16, 24, 27, 29 h.
Figure 3. HPLC cromatograms obtained after
15 h incubation. (a) Tagged protein. (b)
Untagged protein. (c) Control reaction (carried out
with a crude protein preparation of wild type
cells).
 La actividad específica del extracto crudo de la levadura transformada tiene el mismo valor en
orden de magnitud, e incluso mayor al obtenido usando el gen h6h de extractos de HR.

 El epitope de His en la proteína de fusión reduce la capacidad de la enzima para transformar el

alcaloide.

 Las principales ventajas de S. cerevisiae sobre los sistemas vegetales, son la producción de
biomasa en menor tiempo y la disponibilidad de su genoma conocido y secuenciado.

 Las cepas recombinantes obtenidas son candidatas para la producción de Scopolamine y

Anisodamine por biotrasformación.
Muchas Gracias!