Proteasome-dependent autoregulation

of Bruton tyrosine kinase (Btk) promoter

via NF-kB
 Introduccin

Reconocimiento del Antgeno (estimulacin antignica)

BCR (Receptor de antgeno de LB)
Complejos de protenas
+

Transduccin de la seal al ncleo

PLC Activacin de NF-kB

Enfermedades

Agammaglobulinemia Leucemia Linftica Crnica

 Figura 1

Figura 1: Determinar si el proteosoma 26S

tambin regula Btk

Figura 1 a. Por el mtodo de western blot se pudo

evidenciar que a diferentes concentraciones de
MG132 hubo disminucin de la sntesis de Btk en
celulas A20
Resultados
Figura 1b. Las clulas Nalm6 pre-B tratadas con
ALLN (150 uM), MG-132 (10 uM), lactacystin (10
uM) mostraron que Lyn se mantuvo constante, P53
aumento luego de la exposicin al inhibidor. Y Btk
pareci tener mayor inhibicin frente a Lactacystin.

Figura 1c. En las clulas B de bazo, tratadas o no

con MG 132 a 10uM a diferentes tiempos. Fue
reducida totalmente despus de 10h.
 Figura 2

Los inhibicin de la va proteosoma reduce la expresin de otras

quinasas de la familia Tec.

Propsito: Se investigo si al inhibir la va

proteosoma y la va NFK-B por medio de
MG132, generaban una disminucin de
otras quinasas de la familia Tec.

Diseo: Se usaron tres lneas celulares, se

trataron con MG132 por 16 h. y se realiz
Western Blot.

Resultados: Los resultados sugieren que

podra haber un mecanismo comn
responsable de regular la expresin de
estas quinasas.
 Construccin de plsmido y ensayo
de luciferasa
Para la generacin de una protena quimrica GFP-Btk, el ADNc de
Btk se clon en el plsmido pEGFP-C1 usando procedimientos de
clonacin convencionales.

BglII and HindIII

La actividad de la luciferasa se mid
Luminiscencia
 Figura 3

Propsito: Ver los efectos de los

inhibidores de proteasoma en la expresin
de Btk.

Diseo: Transfeccin con vectores de

expresin que codifican Btk-GFP utilizado
lneas celulares, COS-7 y 293T, la clulas
fueron cultivadas en presencia o ausencia
de MG132 por 6 h y se realiz Western Blot.

Resultados:

Las clulas que expresaban Btk al inhibir la

va proteosoma aumento su expresin.
 Figura 3.

Diseo: Se utiliz una lnea de clulas B de

pollo deficiente en Btk que expresaban de
forma estable la Btk humana

Resultados: La expresin de Btk en la

clulas B41-13 hubo un ligero incremento al
tratarla con MG132, pero lo contrario
ocurri en la clulas WT que se observo
disminucin de Btk.

En este sistema particular, el gen Btk se expresa funcionalmente a partir del

un promotor extranjero, respectivamente, pero dentro del mismo entorno
celular. Promotor heterologo.
 Figura 4

Objetivo: Confirmar la reduccin BtK mediante la inhibicin de

proteosoma

FIGURA A

Diseo: Se realiz un Northern Blot y RT-PCR

de clulas A20 tratadas con sin MG132
durante 16 horas.
RT-PCR
Resultados: Inhibicin Btk presencia Inhibidor

FIGURA B

Diseo: Se realiz una RT-PCR de clulas

Ramos tratadas con sin MG132 durante 16
horas. Control: 18 S RNA Normalizar

Resultados: Inhibicin Btk presencia Inhibidor

 Figura 4

v transcription
initiation site

1500 pb

Objetivo : Identificar posibles sitios de unin para factores de transcripcin

(TFBSs) en el promotor de BtK

Metodologa: Anlisis in silico Btk Promotor :TRANSFAC Database 7.0-public y

P-Match software

Resultados: Se identificaron dos sitios putativos de unin al NFkB

Objetivo : Determinar si TFBS son requeridos

funcionalmente

Metodologa: Generaron amplicones de 500 pb y 1000

pb del promotor de BtK y se insertaron plsmido
reportero con el gen lucifersa en celulas A20

Resultados: Los elementos de respuesta estan

localizados estan localizados en la regin de 500pb-
 Figura 4

FIGURA E

Objetivo: Determinar si la inhibicin de NFkB

inhibe la transcripcin de BtK

Diseo: Se realiz un Western Blot de los

inhibidores Bortezomib y Bay11-7085 en clulas
A20 durante 16 horas.

Resultados: la inhibicin de NFkB inhibe la

transcripcin de BtK

FIGURA F

Objetivo: Determinar in vivo la actividad el

promotor de BtK

Diseo: Se realiz una transfeccin

hidrodinamica en ratones NMRI con plasmidos de
promotores de 1000-Btk, estos fueron tratados
con Bortezomib y Bay11-7085.

IVIS imaging system Resultados: la inhibicin de NFkB inhibe la

transcripcin de BtK
 Figura 5.

Los inhibidores de proteosoma suprimen la transcripcin de

Btk, un fenmeno que requiere sntesis proteica de novo.

Inhibidor de proteosoma
Estabilizan IkB.

Ver si la regulacin de la
transcripcin dependiente
de proteosoma require
sntesis de novo.

Wang, F., Yang, J. L., Yu, K. K., Xu, M., Xu, Y. Z., Chen, L., ... & Li, F. F. (2015). Activation of the
NF-B pathway as a mechanism of alcohol enhanced progression and metastasis of human
hepatocellular carcinoma. Molecular cancer, 14(1), 1.
 Epoxomicina

1h
Cicloheximida
LISADO-WESTERN
(detiene sntesis
protica) BLOT

A20
MG132
 Figura 5

Control de
carga

Control interno

Actividad de
los inhibidores
de proteosoma

Aumento global de ubiquitinacin actividad de MG132y Epoxomicina,

efecto inhibido por CHX. No hay efecto en ERK1/2.
Factor lbil (I-kB) involucrado en la regulacin a la baja de Btk.
 Figura 5

Objetivo: Ver si este factor regula la localizacin subcelular de NF-kB. To

Metodologa: Tratamiento con CHX y MG132, divisin en fracciones

citoslicas y nuclear (kit comercial).

Resultado: p65/RelA (subunidad de NF-kB se acumula en el ncleo de

clulas CHX)

Conclusin general: Niveles de factor NF-kB en el ncleo se correlacionan

con el grado de expresin de Btk, pueden ser directamente responsables de
la regulacin transcripcional de Btk.
NF-kB se une directamente al promotor Btk e induce
Figura 6
su transcripcin

http://www.creativebiomart.net/blog/wp-content/uploads/2015/11/fig1.jpg
 Figura 6

Subunidades p50-p65 Sitios de unin al promotor de Btk

 Figura 6

https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/Imag
es/integration/EMSAOverview615x416.jpg
 Figura 6

No se obtuvo un supershift con los anticuerpos Sonda

marcada al extracto nuclear disminudo

Antisuero genera inmunocomplejos antes que supershifts

de oligos que se unen a p50/p65

NF-kB se une in vivo e in vitro al promotor Btk.

 Figura 6

1000-Btk, procedimiento
hidrodinmico

2 seuelos: Wt- 2 Oligos

1, Wt2: Sitios de mutantes: Mu-1,
unin a NF-kB Mu-1

Inters: ver el potencial in vivo de los sitios de unin como

enhancers

Inhibicin in vivo de transcripcin dependiente de NF-kB por

 Figura 6

Objetivo: Ver si NF-kB

mantiene un rol positive
en la regulacin de Bkt

Metodologa: Vector de
expression con
p65/RelA se introdujo
con el constructo 1000-
Btk (gen reportero),
constructo 500-Btk ( Sin
los elementos putativos
de union a NF-kB) y
mutantes con mutacin
en elementos de union 1
o 2 ( Mu1 Mu2 y Mu1+2
de 1000-Bkt )

CONCLUSIN: p65/RelA induce transcripcin de Bkt. Los

dos sitios putativos de union a NF-kB son competentes
 Figura 7
induce su propio promotor a travs de sealizacin NFkB

Transfectados
inicialmente con
constructo NF-kB-
Luc y 4 das
despus Btk activa.

La expresin de Objetivo: Evaluar in

Btk activa la va vivo la estimulacin de
de la NF-kB la va de sealizacin
NF-kB por la Btk.

Metodologa:
Transfeccin de
constructo de NF-kB
con luciferasa y Btk
activa.
LPS genra una
respuesta
similar que Btk
y se inhibe en
 Figura 7

7 veces
mayor
transcripcin

Objetivo: Determinar si Btk

puede o no inducir la
transcripcin de su propio
promotor.

Metodologa:
Cotransfeccin de constructo
reportero 1000Btk y E41K-
Btk.
Figura 7
CONCLUSIO
NES